雷帕霉素抑制的哺乳动物靶点促进PTEN缺乏和PTEN完整胶质母细胞瘤细胞对表皮生长因子受体激酶抑制剂的反应

在癌症中，包括受体酪氨酸激酶在内的细胞内信号的关键调节因子通常过度活跃。这些持续的信号促进肿瘤生长和侵袭，但也可能为治疗提供有吸引力的靶点(1). 胶质母细胞瘤是成年人最常见的原发性恶性脑肿瘤，表皮生长因子受体酪氨酸激酶通常扩增(2, 3). 这种扩增通常与持续活性突变受体的表达有关（EGFRvIII；参考文献。三). 在早期临床试验中，10%至20%的恶性胶质瘤患者似乎受益于EGFR激酶抑制剂埃洛替尼和吉非替尼(4, 5). 我们最近发现EGFRvIII癌基因和PTEN抑癌蛋白的共同表达与两组独立的恶性胶质瘤患者对EGFR激酶抑制剂治疗的临床反应密切相关(6). 我们还发现，EGFRvIII使胶质母细胞瘤细胞对EGFR激酶抑制剂敏感，而PTEN缺失使等基因细胞系统对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性(6). 因为胶质母细胞瘤经常失去或改变PTEN抑癌活性(2, 7, 8)，制定策略以促进这些患者对EGFR激酶抑制剂的临床反应是一项关键挑战。

PTEN缺失通过将EGFR抑制与下游磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途径抑制分离，部分促进对EGFR激酶抑制剂的耐药性(6, 9–11). 因此，我们假设靶向PTEN下游的PI3K/Akt信号通路可以提高PTEN缺陷胶质母细胞瘤细胞对EGFR激酶抑制剂的敏感性。在这里，我们使用两个等基因模型系统，即在相关组合中表达EGFR、EGFRvIII和PTEN蛋白的U87MG胶质母细胞瘤细胞，以及PTEN蛋白表达已稳定恢复的SF295胶质母细胞癌细胞，来检测哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）的作用激酶抑制促进PTEN缺乏肿瘤细胞对厄洛替尼的反应。

细胞系和试剂。人类胶质母细胞瘤细胞系U87MG购自美国类型培养物收藏中心（Rockville，MD），人类SF295胶质母细胞癌细胞购自NCI-60细胞系小组。所有细胞系均常规保存在含有10%胎牛血清的DMEM中。Erlotinib（Tarceva，OSI-774）由Genentech，Inc.（加利福尼亚州南旧金山）提供。雷帕霉素和人EGF购自西格玛（密苏里州圣路易斯）。

基因构建与逆转录病毒感染。将全长人PTEN cDNA克隆到表达载体pcDNA3.1（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，转染到U87MG和SF295细胞中，分离出抗基因选择的单个克隆，生成稳定的细胞系U87MG-PTEN和SF295-PTEN。

从pLWERNL和pLERNL质粒中PCR扩增人EGFR和EGFRvIII cDNA，并分别克隆到逆转录病毒表达载体pLPCX和pLHCX中（Clontech，Palo Alto，CA）。使用自动DNA测序确认了构建的pLPCX-EGFR和pLHCX-EGFRvIII。为了产生逆转录病毒，使用FuGENE 6转染试剂（Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN）将包装系293T与pHIT60、pMDG-VSV-G和pLPCX、pLPCX-EGFR或pLHCX-EGFRvIII之一共转染。48小时后收集高滴度病毒，并按照标准程序感染U87MG或U87-PTEN靶细胞。逆转录病毒感染后，通过限制稀释，在嘌呤霉素（用于pLPCX-EGFR）或潮霉素（对于pLHCX-EGFRvIII）存在下选择单细胞克隆分离物2至4周，每个细胞系扩增6个克隆并通过免疫印迹分析PTEN、EGFR或EGFRvIII的表达。对于每个亚系，选择一个在稳定水平上稳定表达相关蛋白的克隆用于后续实验。

免疫印迹分析。如前所述进行免疫印迹分析(6). 使用针对以下抗原的初级抗体：EGFR/EGFRvIII混合物（Biosource Corp.，Camarillo，CA）；PTEN（级联）；磷酸化-Tyr、Akt、磷酸化-Akt（Ser⁴⁷³，克隆587F11），S6，磷酸-S6（Ser^235/236; 细胞信号技术，马萨诸塞州贝弗利）；和β-微管蛋白（T4026；Sigma）。辣根过氧化物酶结合二级抗体来自细胞信号技术。

细胞增殖试验。每孔4000个细胞接种到96周的平板中。20小时后，细胞被血清饥饿，并在37°C下培养5天。在指定的每个时间点，将平板固定并用0.25%结晶紫甲醇染色，并使用Alpha Imager 2200 V5.04（加利福尼亚州圣莱安德罗Alpha Innotech公司）对细胞进行定量。或者，使用WST-1细胞增殖测定试剂盒（加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）测量药物治疗下的细胞生长。简单地说，将每孔3000个细胞接种在96 well板中，让其粘附过夜，然后在测量生长之前，用含有指定浓度埃洛替尼、雷帕霉素或两者的新鲜完整培养基培养4天。

药物敏感性分析。每孔96-well板上接种1000个细胞。20小时后，在全培养基中以0至10μmol/L的不同浓度用厄洛替尼处理细胞，每个条件重复8个孔。在0.1 nmol/L雷帕霉素的恒定剂量下，还进行了厄洛替尼（0-10μmol/L）的剂量反应，以研究联合治疗的效果。细胞孵育10至14天，用结晶紫染色，并使用Alpha Imager 2200 V5.04软件定量。从实验井中减去单独介质的背景读数。集成电路₅₀使用微机剂量效应分析软件计算值(12). 通过台盼蓝排除法测定存在或不存在10μmol/L厄洛替尼、1 nmol/L雷帕霉素或两者结合时的细胞死亡。在六孔板的每个孔中电镀5万个细胞，使其粘附，然后用抑制剂处理3至4天，此时将上清液（包含死细胞）和胰蛋白酶粘附细胞混合，轻轻造粒，并重新悬浮在台盼蓝中进行细胞计数。

细胞周期分析。用或不用10μmol/L厄洛替尼培养细胞24小时，然后收集粘附细胞和漂浮细胞，并通过碘化丙啶染色（FACSCalibur流式细胞仪，Becton Dickinson，Mansfield，MS）进行流式细胞周期分析。

PTEN、EGFR和EGFRvIII：对PI3K通路激活和肿瘤增殖的影响。U87MG胶质母细胞瘤细胞PTEN缺乏，表达低水平的野生型EGFR，缺乏EGFRvIII蛋白(13). 我们通过逆转录病毒转导在亲本U87MG细胞中以相关组合表达PTEN、EGFR和EGFRvIII蛋白，选择以下稳定细胞系：U87-PTEN、U87-EGFR、U87-PTEN-EGFR、U87-EGFRvⅢ和U87-PTEN-EGFRvIII(图1A). 在无血清条件下用EGF处理每个细胞系可刺激EGFR磷酸化并促进下游Akt和Erk磷酸化(图1B). 与亲代细胞相比，EGFRvIII被组成性磷酸化，并促进Akt和Erk磷酸化的基线水平增加(图1B). EGF刺激也增强了EGFRvIII表达细胞下游Akt磷酸化，这表明刺激野生型EGFR可能有助于EGFRvIII表达细胞中PI3K通路的激活。PTEN共表达降低了Akt的基线磷酸化，但并没有持续抑制所有细胞系的Erk磷酸化(图1B). 因此，外源表达的蛋白具有生化活性，PTEN的共表达通过PI3K途径调节EGFR和EGFRvIII介导的信号传导。

为了研究PTEN、EGFR和EGFRvIII在这些细胞中表达的功能后果，我们检测了它们对细胞增殖的影响。EGFRvIII在无血清条件下5天内显著促进胶质母细胞瘤细胞增殖(P（P）=0.01），而PTEN共表达显著抑制EGFRvIII介导的增殖(P（P）=0.00006），以及U87MG细胞的增殖(P（P）= 0.01;图1C). 野生型EGFR在无血清条件下对增殖的影响较小，这可能符合野生型EGFR-配体刺激的要求(14). 这些结果表明，这些蛋白在肿瘤细胞中具有功能活性，PI3K通路的慢性激活促进了胶质母细胞瘤细胞的增殖。

EGFR/mTOR联合抑制可增强PTEN缺乏的胶质母细胞瘤细胞的生长停滞，并提供额外的下游PI3K通路抑制。我们之前已经证明，在这些等基因U87MG细胞中EGFRvIII和PTEN的共表达使它们极易受到EGFR激酶抑制剂埃洛替尼介导的生长停滞的影响，这一结果与我们在埃洛替宁治疗的患者中观察到的结果密切相关(6). 这进一步支持了U87等基因细胞系系统的功能有效性。厄洛替尼IC₅₀补充表S1显示了在正常含血清生长条件下测定的这些细胞的值。正如预期的那样，厄洛替尼通过G显著增加来促进细胞抑制反应₁U87-PTEN-EGFRvIII相对于U87-EGFRvIII细胞的分数，以及U87-PTEN细胞相对于U87MG细胞的分数(图2). 通过流式细胞术、形态学分析或聚ADP核糖聚合酶裂解的Western blot分析，我们未检测到细胞凋亡的证据（数据未显示）。Erlotinib单独治疗抑制EGFR和EGFRvIII磷酸化，但只有当PTEN在U87-PTEN和U87-PTEN-EGFRvIII细胞中共存时，下游S6磷酸化才会降低(图3A)与细胞周期分析和我们之前的发现一致(6). 这些结果证实，EGFRvIII/PTEN共表达，以及在较小程度上仅PTEN表达，使胶质母细胞瘤细胞对厄洛替尼介导的生长停滞敏感。他们还支持PTEN缺失通过将EGFR抑制与下游PI3K通路抑制分离来促进对EGFR激酶抑制剂的耐药性的假设(6, 9)，因为EGFR或EGFRvIII磷酸化的抑制不一定转化为下游通路的抑制。

在PTEN缺乏的胶质母细胞瘤中，mTOR激酶持续磷酸化并因此被慢性激活(8)，导致p70S6/4E-BP1信号通路的结构性激活。这种mTOR介导的信号在调节蛋白质翻译和细胞增殖中起着关键作用(15). 在小鼠胶质母细胞瘤异种移植模型中，AEE788（一种双重EGFR/VEGFR2抑制剂）和RAD001（一种mTOR抑制剂）联合抑制mTOR和EGFR信号增强了肿瘤缩小和生存期延长，这表明联合治疗的潜在益处(16). 此外，最近发现EGFR/mTOR联合抑制胶质母细胞瘤细胞具有潜在的协同效应(17). 然而，据我们所知，PTEN对EGFR/mTOR联合抑制作用的影响尚未使用PTEN的等基因模型系统进行研究。因为在PTEN缺乏的胶质母细胞瘤细胞中，EGFR激酶抑制剂似乎无法有效抑制下游p70S6/4E-BP1信号传导(图3A; 裁判。6)，我们假设PTEN缺陷的肿瘤细胞将从EGFR/mTOR激酶联合抑制中获得更大的益处。为了验证这一点，我们比较了在0.1 nmol/L雷帕霉素的恒定剂量下U87等基因细胞系对厄洛替尼的敏感性。同时服用雷帕霉素显著降低厄洛替尼IC₅₀PTEN缺乏细胞系的减少幅度更大（厄洛替尼IC平均减少74倍₅₀)与表达PTEN的对应物相比（埃洛替尼IC平均减少15倍₅₀;图3B; 补充表S1）。在每个细胞对内，厄洛替尼IC的单个折叠减少₅₀由于雷帕霉素的添加，当PTEN缺乏时，雷帕霉素的含量显著增加(P（P）< 0.00001;图3C). 我们还检测到对p70s6K靶点S6核糖体蛋白磷酸化的加性抑制，同时埃洛替尼和雷帕霉素处理的PTEN缺陷细胞的细胞生长下降(图3A). 因此，PTEN缺陷的胶质母细胞瘤细胞似乎从EGFR/mTOR抑制剂联合治疗中获得最大益处。

在一个独立的PTEN缺乏型胶质母细胞瘤细胞系模型中，EGFR/mTOR联合抑制可额外促进生长停滞和细胞死亡。U87MG细胞可能不依赖持续的EGFR信号来生存，因为厄洛替尼或厄洛替尼布/雷帕霉素联合治疗可诱导G₁而不是细胞凋亡。因此，我们分析了厄洛替尼/雷帕霉素联合治疗对SF295胶质母细胞瘤细胞的影响，这些细胞在EGFR抑制剂存在下发生凋亡(6). 由于SF295细胞缺乏PTEN，我们通过逆转录病毒转导稳定地恢复PTEN的表达，以研究其对单一或联合治疗的影响。在表达PTEN的SF295细胞中，基础Akt磷酸化如预期的那样减少(图4A)而单独用10μmol/L厄洛替尼治疗可强烈抑制两种细胞系中的Akt磷酸化，在较小程度上抑制S6磷酸化(图4B). 我们之前已经证明PTEN的表达显著提高了这些细胞对厄洛替尼单药的敏感性(6). 与之前的报告和我们的生化数据一致，SF295-PTEN细胞对4天10μmol/L厄洛替尼单药治疗显示出显著的反应，与对照组相比，增殖减少25%（数据未显示），细胞死亡增加13%(图4C). 相反，在缺乏PTEN的亲代SF295细胞中，厄洛替尼介导的生长抑制（14%）和细胞死亡诱导（5%）明显减弱。雷帕霉素（1 nmol/L）单独治疗与厄洛替尼治疗的结果相似。这些结果证实，与表达PTEN的细胞相比，PTEN缺陷的胶质母细胞瘤细胞对厄洛替尼单一治疗的敏感性较低。

然而，与U87细胞类似，用10μmol/L厄洛替尼和1 nmol/L雷帕霉素联合处理后，S6磷酸化显著降低(图4B). 同样，当埃洛替尼与雷帕霉素联合用于功能检测时，PTEN缺陷的SF295细胞中药物诱导的生长抑制和细胞死亡水平显著提高（分别为38%和14%），与单独使用埃洛替尼可治疗的SF295-PTEN细胞的效果相匹配或超过(图4C). 有趣的是，表达PTEN的SF295细胞对联合治疗也有显著的额外益处，表明增殖减少53%（数据未显示），细胞死亡增加30%(图4C)与对照组相比。在这些细胞中，PTEN的恢复可能仅部分抑制PI3K/Akt通路。因为尽管PTEN表达的SF295细胞中Akt磷酸化水平较低，但磷酸化S6的基线水平没有显著差异(图4A和B)，PTEN对其他Akt臂的抑制作用可能比对mTOR的抑制作用更大。如果是这样的话，即使在PTEN存在的情况下添加雷帕霉素也可以更完全地抑制多个Akt效应器，特别是mTOR。与这些数据一致，联合治疗也促进了G₁两种细胞系中单一疗法的阻滞(图4D).

总之，我们已经证明雷帕霉素提高了PTEN缺陷肿瘤细胞对厄洛替尼的敏感性，而PTEN完整的肿瘤细胞也可能从联合治疗中获得额外益处。在两个等基因模型系统中，我们已经表明，联合抑制EGFR/mTOR激酶对抑制下游PI3K通路信号具有相加作用，并且可以促进生长停滞和肿瘤细胞死亡。综上所述，我们的结果在整个U87亚系和完全独立的等基因SF295胶质母细胞瘤细胞组中的一致性，再加上U87亚系准确模拟埃洛替尼治疗患者的效果的能力(6)，表明我们观察到的结果不是由于细胞系系统的克隆效应。这些结果强调了有效抑制PI3K通路信号传导在确定胶质母细胞瘤细胞对EGFR激酶抑制剂的反应中的重要性。事实上，PTEN表达细胞通过添加雷帕霉素进一步对埃洛替尼敏感，这也表明PTEN可能通过PI3K通路的mTOR依赖和mTOR诱导分支影响埃洛替尼可反应。在一些细胞中，PTEN可能通过抑制mTOR依赖性靶点和通路而引起厄洛替尼敏感性，因此，添加mTOR抑制可提供额外的治疗益处。此外，除Akt外，可能还有其他mTOR调节因子，因为尽管Akt活化显著降低，但PTEN表达的SF295细胞中的S6磷酸化基础并未受到显著抑制。这些结果与我们之前的发现一致，即PI3K信号通路的Akt依赖性和Akt非依赖性分支都调节PTEN丢失对EGFR激酶抑制剂敏感性的影响(6). 正如我们之前报道的那样，PTEN缺失与EGFRvIII磷酸化水平的升高有关(图3A)表明PTEN缺失也可能调节EGFRvIII磷酸化本身，与Akt和mTOR无关(6). 本文的结果为胶质母细胞瘤患者的mTOR/EGFR激酶抑制剂联合治疗提供了强有力的机制基础，无论是对于PTEN缺乏的肿瘤患者还是对于PTEN完整的肿瘤患者。

拨款支持：国家神经疾病和中风研究所拨款NS050151和NS43147（P.S.Mischel），国家癌症研究所拨款CA95616，国家癌症研究基金会研究员奖（W.K.Cavenee）、美国临床肿瘤学会青年研究员奖（I.K.Mellinghoff）、T.J.Martell基金会（G.M.Shackleford）、美国脑瘤协会转化研究拨款（M.Y.Wang）、，加州大学洛杉矶分校肿瘤细胞生物学培训基金由美国国家癌症研究所资助，5T32CA09056（K.V.Lu），Ruth L.Kirschstein国家研究服务奖5F31GM067600（I.Vivanco），Harry Allgauer基金会通过Doris R.Ullmann脑肿瘤研究技术基金，Henry E。辛格尔顿脑瘤基金会、第一阶段基金会、齐灵家族基金会为纪念西吉·齐灵而慷慨捐赠的资金，以及为纪念曙光钢铁而设立的大脑艺术和罗文家族基金会。

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