细胞内钙信号模式反映了人类T细胞的分化状态

总结

刺激T淋巴细胞导致大量基因的钙依赖性激活和抑制。然而，不同T细胞亚群的功能反应是异质的，因为它们的分化导致其对激活的敏感性和细胞因子分泌的改变。在这里，我们研究了CD4和CD8 T细胞亚群中的钙反应模式，以帮助解释它们对激活的不同反应。CD4细胞⁺ CD45RA⁺刚从人类血液中分离出来的T细胞在刺激后发出持续的钙信号，但这比CD4中激发的钙信号小⁺ CD45RO公司⁺细胞。打开在体外CD4的分化⁺ CD45RA⁺CD45RO细胞⁺胞质钙反应水平最初升高，但在以后的分化过程中逐渐下降。产生振荡钙反应或无反应的比例增加，分化伴随着细胞内钙池之间的钙转移。CD8（CD8）⁺T细胞的钙反应比配对CD4小⁺T细胞和显示出不同数量的细胞发出短暂而非持续的钙信号。CD4中振荡细胞的增加⁺ CD45RO⁺种群可能反映了该种群的异质性，特别是在细胞因子产生方面。T细胞分化过程中钙反应的变化模式可以解释细胞在其寿命不同阶段对激活反应的变化，并强调钙信号的数量和质量在决定T细胞激活结果中的重要性。

介绍

T淋巴细胞根据其CD45RA和CD45RO的表达分为不同的亚群，具有不同的激活要求以及不同的信号和功能反应[1，2]。过去，这些亚群与原始细胞和启动细胞广泛相关，在这些细胞中观察到了不同的细胞因子分泌、粘附、贩运和激活依赖性（综述于[三]). CD45RO⁺T细胞增殖更强烈以回忆抗原和CD2/CD3介导的刺激，而CD45RA⁺T细胞对外源性细胞因子的反应较差[2，4，5]。CD45RO⁺T细胞已被证明分泌多种细胞因子，而CD45RA⁺T细胞只分泌白细胞介素（IL）-2[6–8].

这些差异可能是由这两种细胞类型中不同的激活信号通路引起的，特别值得注意的是，据报道[Ca^2个+]_我响应[1，9]对包括细胞因子在内的大量T细胞基因的调节至关重要[10]。[Ca的平均增加更大^2个+]_我在CD4中⁺ CD45RA型⁺与CD4相比⁺ CD45RO⁺据报道，刺激后的T细胞[9]这是由于整个细胞群体的反应更高，而不是只有少数细胞表现出更高的反应。相反，罗宾逊等. [1]发现CD3诱导的[Ca^2个+]_我CD45RO的应答率高80%⁺T细胞与CD45RA的比较⁺子集。

在通过T细胞受体（TCR）刺激T细胞时^2个+]_我在单个细胞中观察到反应模式。这些模式部分由刺激类型、刺激强度和细胞表型决定。[Ca时空变化的重要性^2个+]_我细胞激活后功能结果中的信号强调了研究[Ca]的必要性^2个+]_我单细胞水平的反应[11]。在单个B细胞中，[Ca升高，但短暂^2个+]_我与核因子κB（NFκB）和c-Jun激酶（JNK）的优先激活有关，而[Ca的持续升高较低^2个+]_我诱导活化T细胞核因子（NFAT）和细胞外调节激酶（ERK）的核移位[12，13]。[Ca的模式^2个+]_我导致T细胞中转录因子差异激活的信号尚不清楚，但有一些迹象表明确实如此，因为引起增殖反应的刺激与持续但适度的[Ca]增加有关^2个+]_我但不是随着单个细胞的短暂增加[14，15]。转录因子的差异激活可能由T细胞中不同的钙信号引起，正如在B细胞中所证明的那样，有强烈的证据表明钙反应模式对T辅助因子1（Th1）中转录激活因子的调节不同和Th2 T细胞导致其对比性细胞因子表达[16]。因此，[Ca的差异^2个+]_我反应模式可能是转录因子差异表达的基础，因此CD45RA的功能存在差异⁺和CD45RO⁺T细胞。

在人类病理学中，钙反应降低与T细胞功能反应降低有关[17，18]以及产生振荡钙反应的T细胞数量的增加[19]。类风湿关节炎关节中的T细胞主要是CD45RO⁺记忆表型[20]，这可能会增强钙反应[1]，但CD45RB的表达非常低，表明它们属于晚期记忆类型[20]。由于这些细胞在有丝分裂刺激下增殖不良，它们也可能产生减少或振荡的钙信号，导致其功能表型，但对高分化T细胞中钙信号的研究尚未报道。

在本研究中，我们检查了[Ca的模式和大小^2个+]_我不同CD4和CD8 T细胞亚群激活后单个细胞的反应，以及CD4 T细胞在不同阶段的反应在体外区别。我们发现细胞内钙池发生了变化，钙反应总体下降，并随着细胞分化而变得更加振荡，这可能解释了记忆和晚期记忆T细胞功能的变化。

材料和方法

T细胞亚群的分离

如前所述，在Ficoll-Paque（英国Little Chalfont，GE Healthcare）上用离心法从健康志愿者制备外周血单核细胞[19]。该研究得到了南伯明翰地方研究伦理委员会的批准，并在捐赠者知情同意后采集样本。在37°C的血清涂层培养皿上粘附1小时后，使用抗体（针对CD11c、CD14、CD16、CD19、糖蛋白、人类白细胞抗原D相关和TCRγδ）和磁珠的混合物去除非粘附细胞中的非T细胞。为了获得特定的T细胞亚群，添加了额外的抗体，如下所示：针对CD4⁺ CD45RA⁺添加T细胞抗CD45RO和抗CD8；用于CD4⁺ CD45RO公司⁺加入T细胞抗CD45RA和抗CD8；用于CD4⁺加入T细胞抗CD8；和CD8⁺添加T细胞抗CD4抗体。这个阴性选择程序重复了三次。将产生的T细胞分离用于[Ca^2个+]_我使用Coulter Epics XL型细胞仪进行流式细胞术研究并评估细胞表型。细胞制备大于所需表型的95%。

T细胞培养

CD4细胞⁺ CD45RA⁺如上所述，从整个外周血中分离出纯度至少为95%的T细胞。以1:10（EBV转化的B细胞：T细胞）的比例将来自同一个体的γ射线（3000 Rad）爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）转化的培养B淋巴细胞添加到初始培养中，T细胞的密度为0.25×10⁶/毫升。培养基由含有2 mM谷氨酰胺的RPMI-1640、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1%丙酮酸钠、1%非必需氨基酸、1%HEPES和5%人血清组成。添加浓度为1μg/ml的植物血凝素（PHA-P）（Sigma，Poole，UK）作为培养的初始刺激物。为了维持培养，在培养第4天添加25单位/ml重组人IL-2，并在第7天和第11天用新鲜培养基喂养细胞。第14天，移除细胞以测量[Ca^2个+]_我重复第1天的反应和培养周期。该刺激周期重复两次，以便对第0、14、28和42天的细胞进行比较。在整个培养期间，使用流式细胞仪跟踪细胞纯度和分化情况，特别是评估细胞的CD45RB亚型表达，如之前使用该培养系统所示，到第28天时，该亚型表达降至非常低的水平[21].

[加利福尼亚州^2个+]_我单细胞离子成像测量

如前所述，使用Fura-2（英国佩斯利Invitrogen）负载细胞评估单细胞钙反应[19]使用10μg/ml PHA-P作为激动剂。我们选择使用单一浓度的这种广泛使用的激动剂，以便能够将结果与之前使用患者淋巴细胞发表的结果进行比较[19]在不同人类T细胞亚群的功能研究中[22]。单细胞成像系统（Ionvision，Improvision，Warwick，UK）使用含有已知[Ca^2个+]含2μM游离呋喃-2。数据被传输到Microsoft Excel电子表格中，[Ca^2个+]_我根据每个单元格的时间绘制。[加利福尼亚州]^2个+]_我如前所述，反应分为峰值-平台、振荡、瞬态或无反应[19，23]使用其他人使用的类似分类系统[24]。组的定义如前所述[19，23]as：（i）无反应：PHA-P刺激后[Ca21]i信号无增加；（ii）振荡响应：在10分钟的时间内，有三个或更多的峰谷周期；（iii）瞬态响应：峰值响应后返回基线[Ca21]i；和（iv）峰值-平台反应：峰值反应后是相同或更低水平的持续平台，但不返回基线。任何在磁场中显著移动的细胞都被排除在分析之外，因为这种异常反应影响了整体分析。在一些实验中，这种分类借助于模式识别的神经网络计算方法，我们已经证明，这种方法可以对70%以上的被评估细胞进行分类[19，23].

[加利福尼亚州^2个+]_我荧光光谱法测量

纯化的T细胞在2·5×10时再次悬浮⁶1·4 mM Ca中的细胞/ml^2个+汉克斯平衡盐溶液（HBSS）+1%热灭活胎牛血清+25 mM HEPES缓冲液+7·5%NaHCO_三 + 10 mM葡萄糖，pH值为7.4（以下简称Ca^2个+HBSS），并在1μM下加载Indo-1AM酯（Invitrogen）[25]。为了确认细胞处于休息状态并产生稳定的基线，在60 s内观察两个发射波长的荧光强度比，然后通过荧光计顶部的光阻挡物添加刺激物。添加刺激后，观察到痕迹，直到达到稳定的平台反应。生成了一个校准文件，允许计算[Ca^2个+]_我根据我们前面描述的荧光强度比[19].

统计分析

A配对t吨-试验用于比较[Ca的模式和大小^2个+]_我不同细胞群在单细胞水平上的反应。P（P）-小于0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

[Ca的量值和模式^2个+]_我CD4反应⁺ CD45RA⁺和CD4⁺ CD45RO⁺T细胞

为了确定[Ca的差异^2个+]_我反应模式可能是幼稚T细胞和记忆T细胞不同功能结果的基础，我们分离了CD4⁺ CD45RA⁺和CD4⁺ CD45RO⁺来自健康志愿者外周血的T细胞，并测量响应PHA-P的钙信号。图1a显示了六名个人供体细胞中荧光计中悬浮细胞胞浆钙的峰值升高，在所有情况下，CD45RO中钙的升高幅度⁺细胞数高于配对的CD45RA⁺细胞。CD45RA的平均升高⁺细胞为233 nM[±89.8标准差（SD）]，而CD45RO中的细胞为233 nM[±89.8标准差（SD）]⁺为306 nM（±95.7 SD），具有统计学意义(P（P） = 0.003）增加30%。

然后我们评估CD4给予的钙反应⁺三个个体的单个细胞水平的T细胞和[Ca^2个+]_我根据我们采用的分类方法，将这两个亚群对PHA-P刺激的反应模式分为“峰值-平台”、“振荡”、“瞬态”或“无反应”[19，23]基于他人之前的工作[24]。可以将所有单元格分配到这些类别中的一个，以前的出版物中显示了单个单元格响应的示例[19，23].

在所有三个供体中，CD45RO中峰值-平台应答者的比例降低，振荡器的比例增加⁺与CD45RA相比，人群（16.2±3.1%）⁺人口（5.5±2.0%）(图1b). 在这两个人群中，暂时应答者或无应答者的比例没有一致的趋势。CD45RO中振荡细胞的增加⁺CD45RO中峰值-平台应答者比例的降低在很大程度上平衡了人群⁺与CD45RA相比的人群⁺人口(P（P） < 0·01). 总的来说，CD45RO中振荡细胞的数量是其三倍⁺而峰值-平台反应者的比例下降了10%以上。

[加利福尼亚州^2个+]_我CD4中的信号⁺进行性分化的T细胞

虽然CD45RA或CD45RO在T细胞上的表达可用于广泛区分幼稚细胞和记忆细胞⁺该亚群由处于不同分化阶段的异质细胞群组成，包括最近启动的（CD45RB^明亮的)和高分化（CD45RB^迟钝的)单元格。分化阶段的变化可能对[Ca^2个+]_我CD45RO中的反应⁺子集。CD45RA⁺在在体外培养物已被证明与CD45RA逐步分化⁺ CD45Rb^明亮的 CD45RO^迟钝的CD45RA表型^- CD45Rb^迟钝的 CD45RO^明亮的表型[21]。因此，我们建立了一个长期的T细胞培养系统来研究进行性分化对单个细胞[Ca^2个+]_我响应。

图2a显示了T细胞培养中发生的表型变化，其中细胞最初表达CD45RA，随着CD45RO的升高，CD45RA迅速下降，这与之前报道的类似[21]。然后将这些分化细胞用于信号研究图2b说明了[Ca的大小^2个+]_我整个细胞群在不同培养日激发的反应。在培养的第一天，当细胞为CD45RA时，反应的大小从293nM（±48.0 SD）增加到424nM（？96.3 SD），具有统计学意义，增加了45%⁺和培养第14天，表型转换为CD45RO⁺ CD45RB^明亮的已经发生。这一观察结果与图1，其中CD45RO⁺细胞的总体反应高于CD45RA⁺细胞。然而，当细胞进一步分化时，钙反应的幅度在统计学上显著下降，低于原始CD45RA的水平⁺细胞制备(图2b)在下一轮刺激后，钙离子浓度进一步下降，以至于在第42天时，钙离子信号很小。

为了评估单个细胞水平上进行性分化对T细胞信号传导的影响，我们研究了单个细胞[Ca^2个+]_我荧光测定研究中使用的相同培养群体的T细胞反应。共检测了6946个培养的T细胞（第1天为3205个，第14天为1261个，第28天为2131个，第42天为349个）。这些数据是从三个不同的实验中，对给定培养日的不同样本细胞进行五到八次不同的刺激得到的(图3).

在第1天到第28天之间，瞬态应答者或无应答者的比例没有一致的变化。然而，振荡细胞的比例持续增加，从第1天到第14天到第28天稳步进展，并且在整个培养期间，峰值-平台反应者的比例随之降低。到第42天，大多数细胞为无应答细胞，占细胞总数的75%以上。这可能有助于解释在培养的这个阶段在大量群体细胞中看到的非常低的总体钙反应(图2). 而处于分化阶段的细胞更容易发生凋亡[21]外源性IL-2的存在和相对高密度的细胞培养具有保护作用，这些培养物的细胞活力保持在78%以上。此外，这些细胞对离子霉素仍会发出钙信号（数据未显示），这表明它们仍然完好无损且染色，但无法通过T细胞抗原受体处理信号。

在T细胞中，细胞质钙的增加来自两个来源：细胞内储存的释放和穿过质膜的流入。储存物的释放在很大程度上控制了质膜通量，正如我们观察到的那样，类风湿关节炎患者细胞内的钙重新分布[18，19]，我们希望评估池是否在分化的T细胞中重新分配。图4显示分化细胞内储存的分析在体外其中，我们用PHA-P连续刺激它们[释放三磷酸肌醇（IP_三)敏感存储]、thapsigargin（释放任何剩余内质网存储）和离子霉素（释放任何残留池）。在培养期间，离子粘蛋白释放的钙没有变化（为清楚起见，未显示），但PHA-P-和thapsigargin释放池之间似乎存在相互关系，后者显示新分化的CD45RO略有下降⁺T细胞与起始CD45RA的比较⁺细胞，然后随着PHA-P池在进一步培养过程中的下降而增加。

[加利福尼亚州^2个+]_我CD4中的信号⁺和CD8⁺外周血T细胞

CD4和CD8 T细胞之间钙反应的差异已有报道，但研究相当有限。我们希望确定我们在CD4中观察到的钙反应的复杂性⁺CD8中也存在T细胞⁺T细胞。

图5a说明了一个具有代表性的实验，在该实验中，CD4人群⁺和CD8人群⁺从同一个体分离出的T细胞均用PHA-P刺激，产生[Ca^2个+]_我使用荧光分光光度法观察和测量响应。当我们在CD4中重复这一点时⁺和CD8⁺从另外三个人身上分离出的T细胞，我们发现这是一个一致的观察结果，[Ca^2个+]_我在CD8中明显较小⁺与CD4相比的人群⁺细胞群(P（P） < 0·05) (图5b).

[Ca的量值降低^2个+]_我在这些CD8人群中⁺T细胞可能是由于[Ca^2个+]_我群体中单个细胞的反应，反应细胞数量的减少或[Ca模式的变化^2个+]_我单个细胞的反应。因此，我们使用单细胞成像来研究模式(图6)[Ca的^2个+]_我响应。CD4细胞⁺和CD8⁺来自四个不同捐赠者的T细胞共有1078个CD4⁺和734 CD8⁺T细胞分析。图6a显示CD4应答模式之间的明显差异⁺和CD8⁺T细胞。与CD4相比⁺T细胞，CD8⁺T细胞的峰值-平台反应比例降低，瞬态和无反应细胞比例增加，而振荡细胞的比例相当。

当分析的1812个细胞的结果聚集在一起时，CD8中的峰值平台减少，而无反应细胞增加⁺人口具有统计学意义(P（P） < 0·01），而瞬态响应的增加在P（P） < 0.05。总的来说，峰值-平台反应细胞的比例降低了32%，而瞬态和非反应细胞的比率增加了243%。在所有四个供体中，CD8的中位反应⁺人群低于CD4⁺人口。这种差异在每种情况下都具有统计学意义(P（P） < 0·01).

在这些实验中，CD4⁺和CD8⁺我们使用的种群可能包含处于不同分化阶段的细胞，我们使用这些细胞是为了能够将我们的结果与之前发布的数据进行比较。然而，这些细胞的分布可能非常不同，因为CD8⁺T细胞在病毒感染后会发生非常迅速的群体变化[26]。因此，我们分离出CD4⁺ CD45RA⁺和CD8⁺ CD45RA⁺来自一些捐赠者的T细胞，并比较了这些“原始”细胞的钙反应模式。两组中的大多数细胞都出现了峰值-平台反应(图6b)两个亚群包含相同数量的振荡细胞。然而，CD8细胞产生的瞬态反应明显较少，这与无反应细胞的增加相平衡。CD8中瞬态响应器数量的减少⁺ CD45RA⁺细胞群表明CD8⁺ CD45RO⁺实验中出现的细胞图6a可能包含了在这些实验中看到的大量瞬态响应。

讨论

我们的结果清楚地表明[Ca^2个+]_我在单个细胞水平上，人类原始T细胞亚群之间的反应不同。CD4细胞⁺ CD45RO公司⁺记忆性T细胞表现出振荡细胞比例增加，与峰值-平台反应者比例下降的趋势一致，并且根据其分化状态的不同，反应幅度也不同。CD4细胞⁺长期培养的T细胞逐渐分化为CD45RA^- CD45RO⁺ CD45RB型^迟钝的在培养过程中，随着时间的推移，峰-平台比例下降，振荡细胞比例增加。CD8（CD8）⁺与CD4相比，T细胞表现出峰值-平台应答者比例降低，短暂和无应答者比例增加，应答幅度降低⁺来自同一供体的T细胞。

[Ca的较低量级^2个+]_我CD4反应⁺ CD45RA⁺此处报告的T细胞似乎是由于[Ca^2个+]_我反应细胞群体内的升高，而非非反应细胞的比例增加。使用单细胞方法，我们已经证明CD45RO中振荡细胞的比例显著增加⁺T细胞群。这些振荡在平均[Ca方面更有效^2个+]_我因此我们认为这些振荡细胞能够引起CD45RO中增强的功能反应⁺尽管T细胞[Ca的量减少^2个+]_我它们分化时的高程。[Ca的模式^2个+]_我反应与T细胞增殖和细胞因子产生方面的功能结果相关。特别是，持续的[Ca^2个+]_我NFAT核移位需要海拔[27]IL-2的产生和增殖[14，24]。返回基线[Ca^2个+]_我，NFAT迅速重定位到细胞质，导致IL-2转录停止[27]。因此，峰值-平台响应导致[Ca持续升高^2个+]_我，有望推动NFAT的核移位以及随后的IL-2转录和细胞增殖。给予这种钙的T细胞比例^2个+]_我类风湿关节炎T细胞中PHA-P刺激后的反应模式（峰值-平台）降低[19]这可能是这些细胞中IL-2生成和增殖功能缺陷的基础。为了支持这一点，类风湿关节炎关节的T细胞表现出最大的功能缺陷，也显示出峰值-平台反应者的比例大幅降低[19].

虽然我们使用CD45亚型表达作为T细胞广泛分化变化的标志，但CD45表达对信号传递和细胞因子产生的直接影响可能是由于CD45磷酸酶亚型功能的差异所致[28]。CD4细胞⁺ CD45RO⁺T细胞具有广泛的CD45RB表达水平，这取决于T细胞的分化阶段[21]。相反，CD45RA⁺T细胞均为CD45RB^明亮的使用经过多轮刺激的培养T细胞，从而逐渐分化为CD45RB^迟钝的在这种状态下，我们发现振荡细胞的比例越来越高，峰值-平台反应细胞的比例越来越低。CD45RO中钙反应的增加幅度⁺一轮刺激后产生的细胞可能是由I的表达增加引起的_{中俄国际商用飞机有限责任公司}活化T细胞中可增加10倍的通道[29]，作为CD45RO⁺细胞具有活化细胞的一些特性。T细胞中的钙振荡主要是钙内流变化的结果[30，31]这反过来又受到膜电位的影响[32]受钾离子通道调节[33]这些成分的差异表达[34]或钙通道蛋白的不同剪接变体[35]也可能影响子集信令响应。

除了CD45RB的差异表达外，静止的原始T细胞在细胞因子方面的分化可能较小[36]。由于细胞因子受到不同转录因子的调节，分泌Th1细胞因子的细胞可能表现出不同的[Ca^2个+]_我与分泌Th2细胞因子的反应模式进行比较。[Ca的大小和模式^2个+]_我信号已被证明调节B细胞中不同转录因子的差异激活[12]有证据表明，不同的转录因子在Th1和Th2细胞中调节细胞因子基因表达模式[37]。IL-4启动子包含五个对IL-4诱导表达至关重要的位点。NFAT家族蛋白特异性结合到这些位点，并与AP-1因子协同诱导IL-4转录。然而，干扰素（IFN）-γ启动子对NFAT蛋白的依赖性较小，但包含一个需要NFκB结合的调控区域[16]。鉴于JNK-1、NFκB和NFAT的差异激活，[Ca^2个+]_我预期与NFAT激活和IL-4生成相关，而非持续增加可能导致NFκB和JNK-1激活，从而产生IFN-γ。为了支持这一点，来自Itk基因敲除小鼠的T细胞未能产生持续升高的[Ca^2个+]_我并证明NFATc易位受损，无法建立稳定的IL-4生成，而IFN-γ生成不受影响[38，39].

在胸腺细胞中，TCR结合的亲和力可以决定钙反应的类型，但这取决于细胞的成熟状态；高亲和力交战引发振荡响应[40]。同样，在成熟T细胞中，TCR参与的热情也会影响结果。在短期研究中，Verheugen显示，在激活后的前5天，振荡细胞数量增加，并且有更高的刺激激发振荡反应的趋势[41]。高亲和力可导致Th1分化，而对Th2的亲和力较低。因此，我们在CD45RA和CD45RO之间看到的振荡细胞的增加可能代表了这种分化为功能类细胞。同样，SHIP表达的改变可能会改变B细胞中钙的振荡或幅度反应[42]，但其在T细胞中的作用尚未得到研究。里卡德建议T细胞至少有两个钙池，它们参与产生钙尖峰和振荡[43]。我们观察到的具有分化状态的池中的变化可能代表了在不同发育阶段产生不同信号的调制。

CD8（CD8）⁺T细胞显示瞬时和无反应细胞比例显著增加，峰值-平台反应细胞比例下降，[Ca^2个+]_我与CD4相比的反应⁺T细胞。这可能是由于CD8激活阈值增加所致⁺T细胞，这可能代表一种重要的保护性生理机制，通过这种机制，细胞毒性T细胞不太可能经历不适当的激活，从而对健康组织造成严重损伤。此外，短暂的钙信号可能是诱导细胞毒性颗粒释放的充分和必要条件[44]这可能解释了我们在CD8中观察到的瞬态响应者比例增加的原因⁺细胞数量。

我们在CD4中看到的反应模式⁺类风湿关节炎关节的T细胞[19]与CD4中的模式相似⁺ CD45RO⁺T细胞和CD4⁺长期培养后的T细胞中，振荡器的比例较高，而峰值-平台反应器的比例相对较低。然而，CD45RO中无应答者的比例没有增加⁺T细胞，在培养的T细胞中仅在第42天出现，几乎所有的T细胞都无法对随后的PHA-P刺激作出反应。激活的T细胞的[Ca^2个+]_我TCR刺激后的振荡[32]，这提出了[Ca频率增加的可能解释^2个+]_我CD4中的振荡⁺CD45RO⁺人口。此外，鉴于叉头盒p3的功能依赖于其与钙调节NFAT蛋白的相互作用，该人群中很可能存在调节细胞[45]钙振荡可能在调节这一重要细胞亚群的功能或功能障碍中起重要作用。

CD4的最新表型和细胞因子分析⁺人类T细胞表明至少存在六种细胞亚群[22]。其中一些未能对PHA作出反应；这些可能是效应细胞，可能与我们所产生的终末分化细胞中未能发出钙信号的大量细胞相对应。这些主要是IFN-γ分泌细胞[22]考虑到IFN-γ启动子明显缺乏钙依赖性，且其完全缺乏NFAT位点，这进一步支持了这些细胞可能对应的说法。其他细胞仅表达IL-2，这些细胞可能与我们的钙振荡细胞或峰值-平台反应细胞相对应，尽管振荡细胞更多出现在分化细胞中，这些分化细胞可能分泌较少的IL-2，但可以代表可能更多钙的Th2细胞^2个+-依赖性是因为IL-2启动子的NFAT依赖性。CD45RA与原始T细胞相关，因此人们可能期望这种细胞的信号反应不那么复杂。事实上，我们已经看到这些细胞的主要反应是峰值-平台模式。然而，CD45亚群可能包含“恢复”为CD45RA的记忆细胞群⁺并且可以表示中央存储单元的子集[46，47]。至少一些CD45RA⁺细胞对PHA也不能增殖[22]但主要分泌干扰素-γ，再次表明这些是功能分化的效应细胞。因此，T细胞的表型标记描述可能掩盖了另一种功能复杂性水平，而这种复杂性可能更好地由其钙信号反应来表示。

使用单细胞成像和荧光光谱法，我们描述了[Ca^2个+]_我各种新分离和在体外-衍生T细胞亚群。鉴于钙在调节T细胞基因表达中的重要性，我们认为这些差异可能是这些细胞功能变化的基础。

致谢

这项研究得到了威康信托基金会博士生、关节炎研究运动和伯明翰关节炎上诉信托基金会的支持。

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