β的参与^三-肾上腺素受体在衰老心脏β-肾上腺素能反应改变中的作用:一氧化氮合酶1衍生一氧化氮的作用

这项研究，包括对相关动物的护理，是根据法国农业部（A5550-01，法国巴黎）发布的官方法令和《赫尔辛基宣言》的建议进行的。因此，这些实验是在授权实验室中进行的，并在每个机构的授权研究员的监督下进行（EA 3975、INSERM U689和UMR-INSERM 771-CNRS 6214分别为B.R.、C.H.和R.A.）。使用年轻成年（3个月）和衰老雄性Wistar大鼠（24个月）（法国阿尔布雷斯河畔圣日耳曼Charles River）。

使用配备8至14MHz线性换能器的通用电气Vivid 7仪器（法国Aulnay-sous-Bois）对麻醉大鼠（1–2%异氟烷）进行超声心动图检查。数据在线传输至计算机进行分析（EchoPAC PC 2.0.x版；通用电气）。在M型胸骨旁长轴和短轴切面测量左心室直径。左心室射血分数和左心室缩短分数使用改良版Simpson单平面分析进行测量。7,18左室舒张参数由脉冲频谱多普勒二尖瓣血流和脉冲频谱二尖瓣组织多普勒心尖切面成像获得，样本量如前所述在二尖瓣环外侧角起搏。7,18,19使用左心室直径、左心室射血分数和左心室缩短分数评估左心室收缩功能。使用早期（E）和晚期（A）充盈波峰值速度和E/A比值来研究左室舒张功能。7,18,19此外，从脉冲二尖瓣多普勒频谱和二尖瓣组织多普勒频谱获得E波的等容舒张时间和减速时间，以及舒张早期峰值速度Ea。18,19使用E/Ea比值测量左心室舒张末期压。7,18,19腹腔注射多巴酚丁胺（4μg/kg），在心率增加稳定后进行测量。7,18 

如前所述，在Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲溶液中研究乳头肌力学。1,2,7,18,20在用戊巴比妥钠进行短暂麻醉后，心脏很快被切除。解剖并称重整个心脏和左心室，仔细切除左心室乳头肌，并用Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲溶液（118 mm NaCl，4.7 mm KCl，1.2 mm MgSO）垂直悬挂在200 ml的夹套容器中⁴，1.1毫米千赫²人事军官⁴，25毫米NaHCO^三，2.5毫米氯化钙²和4.5mm葡萄糖），并使用恒温水循环器保持在29°C。以12脉冲/分钟的速度对制剂进行场刺激，将5毫秒矩形波脉冲设置在略高于阈值的位置。用95%的O冒泡沐浴液²和5%CO²导致pH值为7.40。经过60分钟的稳定期，初始肌肉长度位于长度-主动等长张力曲线的顶点，乳头肌恢复了最佳的机械性能。细胞外钙浓度²⁺由于大鼠心肌收缩力在2.5mm处几乎达到最大值，因此从2.5mm降至0.5mm。18,20,21根据三次抽搐计算长度-活动等长张力曲线顶点初始肌肉长度的常规力学参数。第一次抽搐是等张的，加载了与长度顶点处初始肌肉长度相对应的预载——主动等张张力曲线。第二次抽搐突然被夹在零负荷后，电刺激与临界阻尼。第三次抽搐在长度顶点处的初始肌肉长度处完全等长-主动等长张力曲线（L^最大值). 我们使用零负荷技术确定了最大空载缩短速度，以及仅在预载情况下收缩达到峰值的时间。此外，从等长收缩中记录每横截面积归一化的最大等长主动力和达到峰值力的时间。研究结束时，根据乳头肌的长度和重量计算肌肉横截面积，假设密度为1。

β-肾上腺素受体刺激由异丙肾上腺素（10⁻⁸到10⁻⁴m） ，一种非选择性β受体激动剂，在酚妥拉明（10⁻⁶m） ，特定α¹-肾上腺素受体拮抗剂。7,18 

评估β的作用^三-肾上腺素受体，我们研究了暴露于累积浓度BRL 37344（10⁻⁸到10⁻⁵m） ，22特定β^三-肾上腺素受体激动剂，在萘妥洛尔（10⁻⁵m） ，特定β¹-和β²-肾上腺素受体拮抗剂。22β的影响^三-β-环磷酸腺苷对肾上腺素受体的刺激作用¹-和β²-使用二丁酰环腺苷一磷酸（5.10）研究肾上腺素受体刺激⁻⁴m） 是一种脂溶性和扩散性的环磷酸腺苷类似物，在细胞内参与时抗水解，7,18在萘妥洛尔（10⁻⁵m） 以及在BRL 37344（10）在场或不在场的情况下⁻⁵m） ●●●●。

评估β-^三-肾上腺素受体途径，我们研究了暴露于N个 ^G公司-硝基左旋精氨酸甲酯（l-NAME；10⁻⁵m） ，一种非特异性NOS抑制剂；至乙烯基-1-N个-5（1-亚氨基-3-丁烯基）-l-鸟氨酸（l-VNIO；10⁻⁴m） ，一种特定的NOS1抑制剂；或达到1400W（10⁻⁴m） 如前所述，是一种特定的NOS2抑制剂。7,22 

添加的药物总量不超过浴缸容量的2%。除L-VNIO和BRL 37344外，所有药物均购自Sigma Chemical（法国L’Isle d‘Abeau Chesne），L-VNIO购自Coger（法国巴黎），BRL 37344购自Tocris Biosciences（英国布里斯托尔）。

同时检测一氧化氮的生成体内和在体外使用铁的技术²⁺二乙基二硫代氨基甲酸酯（Sigma Chemical）作为自旋阱，如前所述。23测量亚硝酸盐氧化物的生成体内，铁²⁺腹腔注射二乙基二硫代氨基甲酸酯（400 mg/kg），同时或不注射多巴酚丁胺和硫酸亚铁⁴-7小时²在成年或衰老大鼠颈部皮下注射O（40 mg/kg）和柠檬酸盐（200 mg/kg）。30分钟后，处死大鼠，从心脏采集左心室，测量一氧化氮。在另一组实验中，在体外将成年大鼠和衰老大鼠的小部分左心室心肌放在24孔簇中，填充250μl含有酚妥拉明（10⁻⁶m） 有或没有异丙肾上腺素（10⁻⁶m） 无论是否存在NOS抑制剂：l-NAME（100μm）、1400W（100μm）或l-VNIO（100μ米）。用250μl胶体铁（Fe²⁺二乙基二硫代氨基甲酸酯）²并在37°C下孵育1小时。所有一氧化氮测量均在桌面x波段光谱仪迷你显微镜（Magnettech，Berlin，Germany）上进行。使用杜瓦瓶在77°K下进行记录。仪器设置为10 mW微波功率、1 mT调幅、100 kHz调制频率、60 s扫描时间和10次扫描。

共聚焦显微镜观察NOS1和NOS2的染色和成像。将左心室心肌切片冷冻并切割成7μm的切片。固定切片在封闭缓冲液中培养（室温下培养2小时）（5%脱脂干乳在磷酸盐缓冲液中）。然后将组织切片与单克隆鼠抗NOS2抗体（1:100；德国海德堡转导实验室）或抗NOS1抗体（1:100；转导实验室）孵育过夜（4°C）。在三次清洗后，分别用次级小鼠和兔子培养（1小时，37°C）荧光Alexa荧光488标记抗体（1:100；Invitrogen Molecular Probes，荷兰莱顿）。用配备有氩离子激光器（EM 488nm）的奥林巴斯光学显微镜Fluoview FU 300激光扫描共聚焦成像系统（Olympus，Paris，France）检查载玻片。照片是用10倍物镜拍摄的（浸水）。激光器调整为绿色荧光模式。Z系列以1μm的步长采集，叠加后获得最终图像。

用特异性抗体对左心室匀浆进行Western Blots检测β¹-和β^三-肾上腺素受体，如前所述。7,18简言之，在4°C下将心肌细胞在Triton X-100缓冲液（1%Triton X-10050 mm Tris-HCl[pH7.4]、100 mm NaCl、50 mm NaF、5 mm EDTA、40 mmβ-磷酸甘油酯、0.2 mm原钒酸盐、0.1 mm亮氨酸蛋白酶和0.001 mm抑肽酶）中均质1 h。15000离心后克在4°C下持续15分钟，使用BCA蛋白质检测试剂盒（法国布雷比埃尔Perbio Science）测量上清液蛋白质浓度。如前所述制备蛋白质，7,18用抗β抗体免疫印迹每车道50μg蛋白¹-肾上腺素受体（1:1000；亲和生物试剂，法国圣昆廷伊夫林）和山羊多克隆抗–β^三-肾上腺素受体（1:1000；Santa Cruz Biotechnology，Le Perray en Yvelines，法国）。所有Western blot实验均采用归一化方法进行量化，包括通过在每个凝胶上加载参考样品来标准化不同的凝胶，并通过测量S-Poneau染色膜上的总蛋白水平来检查是否加载了类似的总蛋白量。S-Poneau染色使我们能够验证装载了等量的蛋白质。因此，所有结果都用一个连接（肌动蛋白）和膜上转移的蛋白质量进行了标准化。通过使用看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶进行Western blot进行对照，并验证我们手中的蛋白质凝胶负载量没有变化。

数据表示为平均值±SD。如前所述，确定了最大效应和产生50%最大效应的浓度。1,2,7,18,20,24使用配对学生对两个平均值进行比较t吨测试。在适当的情况下，使用单向或双向方差分析对几种平均值进行比较。在需要时使用重复测量方差分析事后（post-hoc）使用的测试是纽曼-基尔斯测试。全部P（P）值是双尾的，并且P（P）值小于0.05被认为是显著的。使用NCSS 2007软件（爱尔兰科克统计解决方案有限公司）进行统计分析。

我们研究了49只年轻成年大鼠和60只衰老大鼠。为了用分离的左心室乳头肌和蛋白质表达来评估机械变量，我们研究了31个年轻成人和42个衰老心脏。这种差异是因为在衰老大鼠中更难去除和获得稳定的制剂。进行一氧化氮评估、染色和成像体内每个年龄段12只大鼠。进行一氧化氮评估在体外每个年龄段6只大鼠。

衰老大鼠体重显著增加（551±130与。328±35克；P（P）<0.05）和心脏重量（1078±185与。664±72毫克；P（P）<0.05）。然而，心脏重量与体重之比（2.1±0.8与。2.0±0.2毫克/克；不显著[NS]）和左心室重量与体重之比（1.62±0.52与。1.63±0.21毫克/克；NS）在年轻成年大鼠和衰老大鼠之间没有显著差异。

体内，将基线超声心动图特征与年轻成年大鼠（n=12）和衰老大鼠（n=9）进行比较。年轻成年大鼠和衰老大鼠的心率无显著差异（340±14与。分别为342±11次/min；NS）。衰老大鼠的收缩功能得到了保护，年轻成年大鼠和衰老大鼠左心室射血分数（86±5与。  90 ± 5%; NS）和左心室收缩率（54±5与。  56 ± 8%; NS）。相反，衰老组的舒张功能发生改变，表现为等容舒张时间显著延长（22±1与。30±4毫秒；P（P）<0.05），E的减速时间受损（44±7与。32±6毫秒；P（P）<0.05）和E/A比增加值（1.2±0.1与。  2.7 ± 1.1;P（P） < 0.05). 对两只年轻成年大鼠进行A、E/A比率和等容松弛时间的评估在技术上是不可能的。与年轻成年大鼠相比，左室舒张末期压力增加，如E/Ea比率增加（13.1±2.5）所示与。  17.7 ± 4.3;P（P） < 0.05).体外使用左心室乳头肌（年轻人56例，衰老心脏56例），衰老组在两种低负荷条件下的肌力特性都发生了显著改变（最大无负荷收缩速度为3.21±0.39与。2.60±0.60升^最大值/s；P（P）<0.05）和高负载条件（每横截面积归一化的最大等距主动力，60±17与。51±18毫牛/毫米²;P（P）<0.05）。衰老大鼠的收缩时间增加，表现为峰值缩短时间延长（175±16与。206±24毫秒；P（P）<0.05）和达到峰值力的时间（150±15与。177±25毫秒；P（P） < 0.05).

β-肾上腺素受体刺激对年轻成年大鼠产生显著的正性肌力作用体内  (表1)和在体外  (表2和图1A). 这种正向肌力作用在两种情况下都显著减弱体内  (表1)和在体外  (表2和图1B)在衰老大鼠中。

体外、l-NAME、l-VNIO和1400W就其本身而言未显著改变青年组或老年组每横截面积标准化的最大等长主动力（数据未显示）。使用l-NAME、l-VNIO或1400W，在年轻成年大鼠中，β-肾上腺素受体刺激的正性肌力作用没有显著改变(表2和图1A). 在衰老大鼠中，l-NAME和l-VNIO部分恢复了β-肾上腺素受体刺激的正性肌力作用(表2和图1B). 相比之下，1400W对这种正向肌力作用没有显著影响(表2和图1B).

BRL 37344在纳多洛尔（一种选择性β¹-和β²-肾上腺素受体拮抗剂，适用于年轻成年鼠（101±5%；NS）或衰老大鼠（98±7%；NS）。二丁酰环腺苷一磷酸在年轻成年大鼠和衰老大鼠中的正性肌力作用没有显著差异(图2). BRL 37344显著降低衰老大鼠的二丁酰环腺苷一磷酸的正性肌力作用，但在年轻成年大鼠中没有(图2).

与乳头肌实验中观察到的功能变化一致，我们发现β¹-与年轻成人心脏相比，衰老心脏的肾上腺素受体减少了33%(图3). 相反，β^三-与年轻成人心脏相比，衰老心脏中肾上腺素受体蛋白表达显著增加(图3).

在年轻人的心脏中，β-肾上腺素受体的刺激没有诱导任何一氧化氮的产生体内  (图4)或在体外  (图5A).体外与对照组相比，l-NAME消除了一氧化氮的生成，而l-VNIO或1400W没有任何显著影响(图5A). 与异丙肾上腺素组相比，l-VNIO显著降低了一氧化氮的生成(图5A).

然而，在衰老的心脏中，一氧化氮的产生随着β-肾上腺素受体的刺激而显著增加，这两种情况都存在体内  (图4)和在体外  (图5B).体外，l-NAME废除了一氧化氮的生产。l-VNIO和1400W均减少了约50%的全球一氧化氮产量(图5B).

与年轻成年大鼠相比，衰老左心室心肌中NOS1和NOS2蛋白免疫反应显著增强(图6).

在目前的研究中，我们证实了β-肾上腺素受体刺激的正性肌力作用被改变体内和在体外衰老大鼠心脏。两者都有体内和在体外，我们提供了β参与的证据^三-肾上腺素受体在衰老心脏β-肾上腺素受体刺激的正性肌力效应降低中的作用，与β¹-肾上腺素受体与β的上调^三-肾上腺素受体蛋白表达。体外，NOS1似乎是β^三-肾上腺素受体途径。这些发现表明β^三-肾上腺素受体在与衰老心脏相关的β-肾上腺素能功能障碍中起着重要作用。

体内我们已经证实，衰老心脏的左室舒张功能障碍使得左室射血分数保持不变，脉冲频谱多普勒二尖瓣血流“限制性充盈模式”和左室舒张末期充盈压力增加。2,25,体外，我们已经证实与低钙相关的收缩速度延长有关的肌力异常²⁺从肌浆网释放，25,26较慢的跨桥循环速率，26以及导致瞬时外向钾电流I的去极化钾通道密度降低^到.27,28最大空载缩短速度的损害可归因于肌球蛋白重链亚型与低腺苷三磷酸酶活性（β-MHC）的转换。26每横截面积标准化的最大等长主动力减少是由于纤维化和凋亡导致肌原纤维含量减少所致。2,25正常收缩功能之间的常规对比体内和心肌肌力异常在体外提示存在神经体液代偿机制，可使心脏维持正常心输出量。25 

在衰老的心脏中，β-肾上腺素能受体刺激的正性肌力效应同时被改变体内和在体外 .3,4,29,30在这种情况下，二丁酰环腺苷一磷酸在年轻人和衰老组中诱导了类似的正性肌力作用，表明β-肾上腺素能途径的大多数异常位于蛋白激酶A激活的上游。同时下调β¹-和β²-肾上腺素受体已经建立，4我们首次证明了β^三-衰老大鼠左心室心肌肾上腺素受体上调。当使用BRL 37344时，二丁基环磷酸腺苷诱导的变力作用受损证实了β^三-肾上腺素受体通路参与衰老心脏。当特定β¹-和β²-肾上腺素受体拮抗剂（那多洛尔）的使用似乎是矛盾的。事实上，那多洛尔抑制β诱导的环磷酸腺苷的生成¹-和β²-肾上腺素受体刺激。在这种情况下，环磷酸腺苷的浓度可能不足以诱导任何β^三-肾上腺素受体效应。另一方面，当使用二丁酰环腺苷一磷酸恢复细胞内的环腺苷浓度时，BRL 37344诱导的负性肌力效应显著降低了二丁酰环腺苷一磷酸盐诱导的衰老心肌正性肌力作用。正如先前报道的那样，β-肾上腺素受体刺激诱导的一氧化氮生成仅是β^三-肾上腺素受体途径。9因此，增加的一氧化氮生成评估了体内和在体外用β-肾上腺素受体刺激支持β^三-肾上腺素受体参与β-肾上腺素能功能障碍。此外，我们研究中使用的二丁酰环腺苷一磷酸浓度被认为对成年大鼠产生最大的正性肌力作用。7,20然而，由于β¹-肾上腺素受体-Gs蛋白偶联和腺苷酸环化酶活性改变。3,15,16因此，β的负性变力效应的大小^三-肾上腺素受体刺激可能被低估。与此相反，如前所述，β^三-幼年大鼠心肌中的肾上腺素受体不明显。7 

在我们最近对衰老大鼠缺血性心力衰竭的研究中，我们证明与匹配的对照组相比，NOS1与肌浆小窝蛋白-3的结合表达上调，而NOS3的表达降低。11在另一项针对糖尿病心肌病的研究中，我们报道了β^三-肾上腺素受体刺激仅由NOS1与肌浆小窝蛋白-3偶联而发出。7在本研究中，使用电子顺磁共振体内和在体外 11进一步证明，β-肾上腺素能受体刺激诱导的一氧化氮生成涉及衰老大鼠的NOS1和/或NOS2。然而，我们的结论不能更具体，因为记录到的一氧化氮生成中只有约50%是由β^三-肾上腺素受体刺激。其余一氧化氮来自其他来源，被非特异性一氧化氮合酶抑制剂（l-NAME）阻断。通过免疫标记和共聚焦显微镜观察，与青年心肌相比，衰老心肌中NOS1和NOS2均上调。然而，在体外使用左心室乳头肌，NOS1的作用似乎仅限于β^三-肾上腺素受体途径，而NOS2抑制并没有显著增加β-肾上腺素受体刺激的正性肌力效应。因此，NOS2有助于一氧化氮的生成，但与β^三-肾上腺素受体途径。我们的研究结果支持了心脏NOS1衍生的一氧化氮参与β-肾上腺素能（β¹-和β^三-肾上腺素受体亚型）在衰老心脏中的收缩反应，这可能部分解释了在围手术期或感染性休克危重监护期间，与较高儿茶酚胺含量相关的血流动力学不稳定性增加。31–33因此，这些发现表明，对β肾上腺素能刺激的部分显著改变反应可以通过β^三-肾上腺素能受体途径，并能通过肌力效应至少部分恢复心输出量。需要进一步的研究在人类身上证实这些假设。

在评估我们结果的临床相关性时，应考虑以下几点。首先，本研究在大鼠心肌上进行，这与人类心肌不同。其次，本研究的一部分在体外只涉及内在的心肌收缩性。使用不同的肾上腺素受体激动剂或拮抗剂和不同的NOS抑制剂对心功能观察到的肌力作用与以下几种因素无关体内因素，如心脏负荷的变化、自主神经系统和代偿机制。25然而，使用五种不同技术获得的融合结果值得注意。第三，尽管已知β-肾上腺素受体部分激动剂多巴酚丁胺（dobutamine）诱导的腺苷酸环化酶活性、峰值钙瞬变和收缩细胞缩短的程度略低于β-肾上腺素能受体完全激动剂异丙肾上腺素（isoproterenol），34,35我们选择使用这两种不同的非选择性β受体激动剂体内和在体外分别是因为多巴酚丁胺是经典用法体内应激超声心动图中β受体刺激的研究7,10,18异丙肾上腺素是常用的在体外用于β受体刺激。7,18,20,36总之，正性肌力作用显著降低体内多巴酚丁胺以及在体外用异丙肾上腺素。第四，部分研究是在卤化麻醉剂暴露期间进行的，这可能会干扰不同类型心肌病的β-肾上腺素能刺激。20,37然而，我们获得的数据体内使用卤化麻醉剂与获得的结果一致在体外 . 第四，抑制β^三-在急性心肌梗死中，肾上腺素能受体可降低其对衰老心脏心律失常的保护作用。35需要进一步研究来验证这一假设。

总之，在衰老的心脏中，β^三-肾上腺素受体在β肾上腺素能刺激的收缩反应改变中起重要作用通过诱导NOS1-一氧化氮。

作者感谢David Baker，D.M.，F.R.C.A.（法国巴黎Necker-Enfants Malades中心医院大学麻醉与危重症护理系麻醉科工作人员）审阅了手稿。作者还感谢Sophie Besse博士（法国克雷泰尔巴黎第12大学国立理疗师中心7149室，法国克雷泰尔瓦尔马恩河谷实验室，理疗师与理疗师Tissulaires实验室副教授）捐赠了一些衰老大鼠。