CD127表达与FoxP3和人CD4的抑制功能呈负相关⁺T调节细胞

以前使用FoxP3-GFP敲除小鼠进行的研究表明，FoxP3并不总是与CD25表达相关(36). 由于目前人类研究的重点是使用CD25分离和定量T调节细胞，我们分析了不同CD4中FoxP3的表达⁺T细胞亚群。在Ficoll梯度上纯化正常受试者的外周血细胞，并用抗CD4和抗CD25单克隆抗体染色细胞表面。染色后，用单克隆抗FoxP3单克隆抗体进行细胞膜渗透和细胞内染色。如中所示图1虽然CD4的大部分⁺CD25型^你好细胞（门的前2%）是FoxP3⁺（三个个体的FoxP3数量在84.5%至96.8%之间）⁺CD25沉闷甚至阴性的细胞。事实上，如果在所有CD4上评估FoxP3表达⁺CD25型⁺与CD25表达水平无关的T细胞，在27至52.7%的细胞中为FoxP3⁺因此，高达7.5%的CD4⁺T细胞表达这种假定的T调节细胞标记。使用同型对照IgG-Alexa 488未观察到显著染色，而Biolegend的第二个抗FoxP3单克隆抗体也给出了类似的结果（未公布的数据）。FoxP3在CD4细胞中的表达分析⁺CD25型⁻T细胞亚群显示<5%的CD25⁻CD4细胞⁺T细胞表达FoxP3，尽管这一百分比可能被高估了，因为使用了同型对照Ig进行了一些背景染色。然而，考虑到这个门中有大量的细胞，可能至少有一些CD4⁺CD25型⁻FoxP3的T细胞⁺因此，CD4的比例不是<2%⁺T细胞属于假定的T调节细胞亚群，多达CD4的8-10%⁺T细胞可能具有调节性。

为了鉴定与T reg细胞的功能和表型相关的额外细胞表面标志物，进行微阵列分析，比较CD4表达的mRNA⁺CD25型^你好带有CD4的T细胞⁺CD25型^否定从健康供体PBMC分离的T细胞。从三名献血者中制备mRNA，并在Affymetrix U133A基因芯片上制备和测试cRNA。分类参数基于已发表的研究，其中CD4的前1–2%⁺CD25型⁺T细胞被选为T调节细胞亚群的原型(16,37). 在两个亚群之间存在差异的基因中，CD4中IL-7R（CD127）的表达水平低2.4倍⁺CD25型^你好T细胞与CD4的比较⁺CD25型^否定T细胞。为了证实这一发现，从三个独立的CD4中分离出mRNA⁺CD25型^你好和CD4⁺CD25型^否定用实时定量PCR（qPCR）检测T细胞制剂。CD127 mRNA的表达与CD25的表达呈负相关。事实上，CD4细胞的表达水平降低了3.14⁺CD25型^你好T细胞与CD4的比较⁺CD25型⁻T细胞（范围：2.26–4.21倍）。

正如基因表达研究预测的那样，大多数CD4⁺CD25型⁺细胞，尤其是CD4⁺CD25型^你好T细胞CD127低表达(图2 a). 然而，并非所有的CD4⁺CD127型^lo/−T细胞为CD25⁺事实上，CD4的显著百分比⁺CD127型⁻T细胞（该个体中15.8%）为CD25阴性。也就是说，大多数CD4⁺CD25型⁻T细胞为CD127明亮型（73.8%），占基因阵列分析中观察到的差异表达。更重要的是，流式细胞术分析CD127阳性和阴性T细胞亚群中FoxP3的表达表明⁺CD127中有T细胞^lo/–T细胞亚群(图2b). 有趣的是，CD127的相对表达与FoxP3呈负相关，FoxP3表达CD4最高⁺表达最低水平CD127的T细胞。这些结果在20多名受试者中得到一致观察。

在小鼠中也观察到类似的结果。CD4细胞⁺对FoxP3-GFP敲除小鼠分离的T细胞进行CD127染色(36,38). 绝大多数小鼠CD4⁺福克斯P3⁺T细胞为CD127^lo/−(图3 a). 对这些小鼠的进一步分析表明，CD4⁺CD25型⁺福克斯P3⁺T细胞为CD127^lo/−然而，与人类一样，CD127是一个比CD25更好的标记物，因为所有CD4⁺T细胞为CD127^lo/−独立于CD25表达(图3b).

使用多参数流式细胞术进一步研究CD4、CD127、FoxP3和CD25的关系(图4). 绝大多数CD4⁺CD25型⁺CD127型^lo/−T细胞表达FoxP3（该个体中94%）(图4a). 然而，CD4的显著百分比⁺CD25型⁻CD127型^lo/−细胞也是FoxP3⁺（该个体为35%），尽管平均荧光通常小于CD4⁺CD25型^你好细胞。与此形成鲜明对比的是，FoxP3很少⁺CD4中的T细胞⁺CD127型⁺除表达CD25的人群中的一小部分外(图4b). 有趣的是，CD4的回馈⁺CD127型⁺福克斯P3⁺亚群显示CD25在这些T细胞中的表达是中间的，与CD25不同^你好该子集被描述为“经典”T调节细胞（未发表的数据），表明它们可能是一个过渡细胞。最后，值得注意的是，在这个个体中（这是大多数受试个体的代表），FoxP3的显著百分比⁺CD4中的T细胞⁺CD25型⁻CD127型^lo/−T细胞亚群。后门控显示这些细胞落在CD25内^整数人口（未发布的数据）。从10名健康供体获得的PBMC中，先对CD4、CD127、CD25的细胞表面表达进行染色，然后用FoxP3特异性单克隆抗体进行细胞内染色，也观察到类似的结果(图4c和表一). 对多人的检查证实，大多数CD4⁺福克斯P3⁺T细胞位于CD25内⁺CD127型^lo/−子集；然而，在一些个体中，CD25的显著百分比⁻CD127型^lo/−和/或CD25⁺CD127型⁺T细胞为FoxP3⁺。如中所示表一，～40%的CD4⁺CD127型^lo/−细胞为FoxP3⁺相比之下，只有2.5%的CD4⁺CD127型⁺值得注意的是，CD4平均>85%⁺CD25型⁺CD127型^lo/−细胞为FoxP3⁺因此，CD127是一种比CD25更好的细胞表面标记物，用于识别CD4⁺福克斯P3⁺T细胞；然而，细胞表面标志物的最佳组合是CD4⁺CD25型⁺CD127型^lo/−占FoxP3的约80%⁺取决于个人。因此，CD4的广泛门控策略⁺CD25型⁺CD127型^lo/−产生高纯度FoxP3⁺T细胞群与其他亚群的比较(图4b).

数据清楚地显示了FoxP3表达和CD127下调之间的“一般”关系。然而，我们发现FoxP3和CD127蛋白之间存在明显的负相关(图2b). 这些结果表明，转录因子FoxP3和CD127转录之间可能存在直接的结构关系。鉴于之前的研究表明FoxP3抑制基因表达，这一点尤其有吸引力(39). 转录因子结合基因组DNA的染色质免疫沉淀（ChIP）和富含IP的DNA的微阵列杂交（芯片）是一种新的技术，可以在全基因组范围内分析转录因子结合。ChIP-ChIP数据不同于通过测量mRNA水平获得的经典微阵列基因表达数据，因为它们检查基因转录的直接控制，而不仅仅是潜在的间接下游调节。我们对抗CD3/抗CD28扩增的CD4进行了ChIP芯片实验⁺CD25型^你好人类T调节细胞(37). 使用抗-FoxP3或对照兔Ig从核裂解物中沉淀交联蛋白-DNA复合物。去除免疫沉淀材料的交联并进行蛋白酶处理，纯化和扩增DNA。使用GeneChip Human Tiling 1.0R Array Set（Affymetrix 900774）将所得材料与整个基因组杂交，以确定FoxP3结合位点的位置。进行统计分析以确定与FoxP3蛋白而非兔Ig选择性相关的位点。IL-7R启动子区域在FoxP3蛋白免疫沉淀物结合的各个位点中进行评分（未公布数据）。通过qPCR证实CD127启动子结合。跨越CD127启动子区域的寡核苷酸引物用于CD4抗FoxP3免疫沉淀DNA⁺CD25型^你好人类T调节细胞(图5). 与特异性位于IL-7R启动子区域的兔Ig免疫沉淀物相比，从抗FoxP3免疫沉淀物质扩增的CD127 DNA富集程度很高，但基因组上该区域周围的其他DNA序列没有富集。这些数据支持FoxP3对CD127的直接调节。

尽管CD127的低表达与FoxP3的表达相关，但一些研究质疑FoxP3是否始终是人类T调节细胞的标记物。因此，我们检测了CD4的能力⁺CD25型⁺CD127型^lo/−T细胞和其他亚群抑制异基因MLR。根据CD127、CD25和CD4表达将PBMC分为四个亚群。首先，我们检测了单个亚群对异基因APC的反应能力。如图所示图6如前所述，CD4⁺CD25型^你好当用同种异体抗原刺激时，T细胞亚群无反应，这与这些细胞是FoxP3的事实一致⁺组成“经典”T调节细胞亚群。类似地，CD127^lo/−子集，CD25⁺或CD25⁻CD4细胞⁺T细胞或大量CD4⁺CD127型^lo/−T细胞在异基因MLR中有反应，这表明与CD4一样⁺CD25型^你好T细胞，这些细胞是无能的(37). 相反，CD4⁺CD127型⁺T细胞亚群对同种异体抗原反应正常，与文献一致，表明这些细胞代表原始和记忆性T细胞亚组(32,34,40). 当用抗CD3和抗CD28刺激细胞时，也观察到类似的结果（未发表的数据），这表明与“经典”T调节细胞亚群一样，FoxP3表达细胞是无能的。接下来，将不同亚群添加到异基因MLR中，并比较其抑制T细胞增殖的能力。CD4⁺CD127型^lo/−CD25型⁺T细胞亚群对MLR的抑制作用与CD4相同或更好⁺CD25型^你好T细胞(图7). 这很重要，因为该亚群代表至少三倍以上的CD4⁺T细胞包括CD25中间亚群和阴性亚群。因此，CD127不仅仅是CD4的另一个标记⁺CD25型^你好T调节细胞，但允许识别和分离更具包容性的抑制性T细胞亚群。事实上，抑制活性与CD25无关，因为CD4⁺CD127型^lo/−CD25型⁺和CD4⁺CD127型^lo/−CD25型⁻T细胞亚群抑制MLR，尽管在多项研究中CD4⁺CD127型^lo/−CD25型⁺T细胞比CD4更有效地抑制反应⁺CD127型^lo/−CD25型⁻T细胞亚群，尤其是在较低的T调节细胞：T应答者比率下。这些结果与FoxP3表达的百分比和水平较低一致⁺T细胞亚群中的细胞。CD127两者都没有⁺细胞可重复抑制MLR(n个= 9). 这些结果表明CD127是一个足够的标志物来定义CD4⁺T细胞亚群。为了直接证明这一点，PBMC仅根据CD4和CD127的表达进行分类，并在异基因MLR中进行检测。CD4⁺CD127型^lo/−T细胞亚群无反应(图6)和CD4一样有效地抑制MLR⁺CD127型^lo/−CD25型⁺或CD4⁺CD25型^你好T细胞(图7 b).

以前的研究表明T1D患者的T调节细胞数量可能不足(24). 为了研究T1D患者与对照受试者的T reg细胞群的定量差异，用CD4、CD25、CD127和FoxP3对外周血T细胞进行染色。健康对照组和T1D患者染色的典型示例如所示图8 aFoxP3的频率⁺T1D组和对照组受试者各亚群的T细胞无显著差异。这包括假定的CD4⁺CD25型⁺CD127型^lo/−和CD4⁺CD25型⁻CD127型^lo/−T调节细胞。对其他患者和对照进行了分析，所有数据的散点图如所示图8 b虽然FoxP3的百分比⁺CD4中的T细胞⁺两组的T细胞高于CD4的报告值⁺CD25型^你好T调节细胞亚群的模式与先前观察到的模式相匹配。FoxP3的百分比没有显著差异⁺对照和T1D样本之间任何T细胞亚群中的T细胞。例如，CD4⁺CD25型⁺CD127型^lo/−对照组的FoxP3平均值为66.1%⁺细胞（SD 11.3%；范围53.7-82.8%）与健康对照个体（平均65.5%；SD 8.66%；范围45.4-76.2%）相比。这些结果与一些发现CD4百分比差异的报告形成对比⁺CD25型^你好分析T1D受试者的T细胞占CD4的百分比⁺T细胞。

T调节细胞作为维持免疫耐受的重要途径的出现，为更好地理解免疫稳态和治疗干预的潜力提供了机会。然而，与小鼠不同的是，T reg细胞的人类表型一直很复杂。通常，研究人员已经注意到，最具抑制性的T调节细胞与CD4一致⁺CD25染色最亮的T细胞。不幸的是，CD25的精确选通能力相当武断，因为没有其他细胞表面标记可用于明确识别子集。Baecher-Allen建议其他标记物，如HLA-DR，可以对CD4进行细分⁺CD25型^你好子集进一步丰富T调节细胞活性(41). 然而，这个额外的标记表明，T reg细胞的数量甚至比之前建议的还要少，尽管同一组最近发表的一篇论文表明，DR⁻T调节细胞也有抑制作用，但具有不同的动力学和机制(42). FoxP3作为标记这些细胞的特异转录因子的鉴定表明，人类外周血中的T调节细胞数量可能比以前估计的要多，尽管这是由于一些活化CD25中的意外表达而引起的争议⁻T细胞群(30,38). 然而，由于FoxP3不能用作纯化细胞功能的手段，这些研究因缺乏可用于分离这些和其他T细胞亚群以检测T调节细胞活性的细胞表面标记而受到损害。在本文中，我们证明CD127的表达是人类T调节细胞的一个极好的生物标志物，尤其是当与CD25结合时。这些标记物的组合识别了占CD4的7-8%的T调节细胞⁺T细胞，比以前的方法识别出的比例大得多。此外，这些细胞抑制MLR中同种异体反应T细胞的增殖反应，并且自身对相同刺激无反应，这是CD4的共同特征⁺CD25型^你好人类T调节细胞。

这些结果提出了几个关键问题。首先，因为大多数CD4⁺福克斯P3⁺T细胞可能不属于人类T调节细胞的典型大门，用于功能和免疫表型分析的研究可能缺少大量假定的T调节细胞。这对确定各种疾病患者的数量差异具有重要意义。其次，CD4⁺CD127型⁻CD25型⁻T细胞抑制异基因MLR使那些表明FoxP3不是T调节细胞活性“良好”标记物的研究受到质疑。这可能是因为FoxP3是一个很好的标记物，在正常T细胞激活期间出现的小群体实际上是适应性T调节细胞，由于次优或超优的TCR信号传导而扩张。然而，应该强调的是，并非所有FoxP3⁺T细胞必然是T reg细胞，它们的活性可能取决于FoxP3的表达水平和所表达的蛋白质的亚型。然而，这些CD4⁺CD25型⁺CD127型^lo/−一旦分离，可在体外用TGFβ或其他因子处理，以增强这些细胞中的T调节细胞功能。第三，在基于CD25表达的任何分离策略中，对T调节细胞的低估可能会阻碍选择T调节细胞进行体外扩增的努力。识别和选择大量循环在人类外周血中的T调节细胞的能力，特别是那些患有自身免疫性疾病的患者，可能会更容易为免疫治疗扩大足够的细胞数量。最后，CD127作为区分效应器/记忆与T调节细胞的标记物的鉴定可能表明，抗CD127治疗可能适合于治疗自身免疫性疾病，如T1D、系统性红斑狼疮或多发性硬化症。

遗传观察预示着CD127是一个有用的标记。首先，对单个T细胞亚群mRNA的微阵列分析表明，CD127在CD4中的表达水平显著降低⁺CD25型^你好与CD4相比⁺CD25型⁻T细胞。与大多数活化的T细胞快速再表达CD127和记忆性T细胞表达高水平CD127不同，T调节细胞群仍然是CD127^lo/−。这可能有两个原因。首先，T reg细胞可能持续受到CD28依赖的抗原刺激，导致持续的信号传导关闭CD127 mRNA转录。在这方面，值得注意的是，通过抗CD3加抗CD28而非仅抗CD3激活原始T细胞导致CD127的快速下调（未公布的数据），这表明CD28信号是唯一参与调节CD127下调的信号。另外，并非相互排斥的是，该T细胞亚群中FoxP3的表达可能控制CD127的表达。出现这种情况有几个原因。如流式细胞术染色图谱所示，FoxP3表达越多，CD127越少(图2b). 此外，FoxP3在转基因小鼠中的过度表达导致CD127均匀分布^lo/−具有抑制活性的细胞群。最后，使用CHiP分析产生的数据（首先是CHiP-CHiP，然后是CHiP-qPCR）表明CD127启动子是FoxP3结合的靶点。确定CD127的低表达是否确实是体内持续抗原暴露或FoxP3上调导致CD127基因抑制的结果至关重要，尽管这些并不相互排斥。

CD4⁺CD127型^lo/−CD25型⁻尽管FoxP3的百分比⁺这个亚群中的T细胞可以是非常可变的。这些结果表明，CD127标记可能有助于识别不同类型的T调节细胞，包括Tr1和TH3细胞。在这方面，目前有几种设置，包括用抗CD3诱导具有调节表型的T细胞治疗T1D患者(11,31,43,44). 这些研究模拟了用非致瘤性CD3抗体治疗的T调节细胞缺乏小鼠的类似结果(10)，表明除了先前在这些细胞上观察到的较低CD25表达外，还可以使用CD127作为生物标记物来识别“适应性”T reg细胞反应。

研究结果中更有趣的一个方面是记忆性T细胞与T调节细胞中细胞因子受体表达似乎存在二分法。虽然现在有很高比例的T调节细胞表现为IL-7R低和IL-2R阳性，但记忆性T细胞具有相反的表型，表达高水平的IL-7R和低水平的IL-2R。这种差异表达的理论基础尚不清楚，但它可能反映了细胞存活和这些T细胞亚群扩张不同途径的进化。例如，T调节细胞可能在正常体内平衡中发挥关键作用。因此，细胞试图调节在没有致病反应的情况下可能发生的最早的免疫扰动。由于IL-2是由引流淋巴结中活化的T细胞迅速产生的“早期细胞因子”，IL-2可能是唤醒T调节细胞反应的关键信号，该反应可以有效抑制T细胞在这些淋巴组织中的扩张(45). 相反，IL-7通常在炎症部位局部产生，导致效应细胞的存活和扩张。如果这种局部IL-7表达促进了T调节细胞的扩增，可能会适得其反。此外，避免这些受体使用共同γ链的竞争将增强细胞因子功能的功能。最后，应该注意的是，当所有前T细胞和未成熟T细胞都是CD127时，胸腺中的情况可能会非常不同⁺和CD25⁺在发育的这个阶段，其他因素可能会发挥作用，以确定决定T细胞是成为T reg细胞还是原始的传统T细胞的分化途径。

一些研究已经检测了自身免疫性疾病患者T调节细胞的数量和功能。在一些情况下，如多发性硬化、T1D和自身免疫性多腺体综合征II，数据基于CD4的数量和功能⁺CD25型^你好T调节细胞，表明患病个体中的T调节细胞或功能性T调节细胞较少(24,46–48). 然而，在T1D和其他自身免疫性疾病中，有相互矛盾的结果(25,49). 在本研究中，我们重新评估了T1D患者与正常人的T调节细胞。使用新的标记物FoxP3和CD127，我们分析了CD4的频率⁺CD25型⁺福克斯P3⁺CD127型^lo/−T细胞。在这项研究中，很明显，CD4、CD25、CD127和FoxP3表达定义的人类T调节细胞与无自身免疫的对照个体在相同的百分比范围内(图8、a和b）。此外，从T1D患者分离出的T调节细胞的功能无法与健康对照者区分（未公布的数据）。我们无法解释我们的研究与其他研究在T1D领域的差异的基础。有人认为，这种差异可能是基于流式细胞术的细胞分离技术的细微差异或所使用的不同单克隆抗体造成的。然而，我们使用不同的标记物来识别人类外周血中绝大多数的T reg细胞，这可能是对这一患者群体中T reg细胞数量和功能潜力的更明确的评估。最后，值得注意的是，与大多数对照组和T1D受试者相比，一些T1D患者的T调节细胞数量较高。这与其他自身免疫性疾病的一些研究一致，其中CD4的频率⁺CD25型^你好据报道，与对照组相比，T细胞增加。此外，这些结果与小鼠研究相符，表明T1D疾病发病时T调节细胞数量增加，以及其他免疫疾病情况（未公布的数据）。我们假设，与其说T调节细胞缺陷是疾病沉淀的原因，倒不如说T调节基因细胞活性增加，以阻止可能确实对T调节细胞产生耐药性的攻击性更强的效应细胞。

总之，我们已经确定CD127是人类外周血T调节细胞的一个优秀标记物。细胞表面标记物在绝大多数T调节细胞上低水平表达，可区分高达10%的CD4⁺T细胞作为潜在的T调节细胞。此外，在没有CD25的情况下，可以使用细胞表面标记物来分离抑制性T细胞亚群，因此将成为用于诊断和治疗应用的T细胞选择和扩增的有用工具。

人类抗体（PE结合抗CD127、APC结合抗CD25、PerCP结合抗CD4）用于染色和分类，由Becton Dickinson（BD Biosciences）提供。Alexa488-共轭抗FoxP3购自BioLegend，细胞内染色根据制造商说明进行，修改如下：5×10⁵细胞在4°C下用细胞表面标记物染色30分钟，并用1x Fix/Perm缓冲液固定30分钟。三次洗涤后，细胞在含有DNase I（Sigma-Aldrich）的Perm缓冲液中渗透30分钟，然后进行三次洗涤。然后用人IgG阻断细胞，并用抗人FoxP3 Alexa488-conjugated（BioLegend；克隆206D）染色。从指定来源购买以下抗小鼠抗体：抗CD4、抗CD25和小鼠IgG₁（同型控制）（BD Biosciences）和CD127（eBioscision）。

共对16名长期T1D患者进行了研究。患者（年龄范围16-56岁，平均年龄34岁，病程>5年）从芭芭拉·戴维斯儿童糖尿病中心招募。T1D的诊断主要是通过出现生化自身抗体或儿童出现高血糖伴酮症。所有糖尿病受试者均无严重肾病或神经病变。作为对照，还测试了10名无糖尿病家族史的受试者（年龄范围20-50岁，平均年龄29岁）。根据机构审查委员会批准的方案，在知情同意的情况下，根据需要在科罗拉多大学健康科学中心或加州大学旧金山分校获取血样。

人类T细胞是从白斑病患者（太平洋血液中心）中分离出来的。在某些情况下，使用RosetteSep人CD3缺失鸡尾酒（StemCell Technologies，Inc.）进行阴性选择。100–120 × 10⁶PBMC清洗一次，计数，然后在100×10的分选缓冲液（PBS+0.1%BSA+1 mM EDTA）中重新悬浮⁶每毫升15毫升锥形管中。在添加1μl/100万细胞体积的PerCP结合抗CD4、1μl/1万细胞PE结合抗CD127和0.7μl/万细胞APC结合抗CD25抗体后，轻轻混合细胞悬浮液并在4°C下培养30分钟。将冷FACS分选缓冲液添加至15 ml的体积，并将T细胞造粒并在20×10的条件下重新悬浮⁶使用FACSAria（Becton Dickinson）对每毫升标记的T细胞进行分类。各种T细胞亚群的分类门设置为仅包括那些显示CD4特异性荧光的事件，这些事件也在散点图的最低密度区域内。这相当于11.4%至33.9%（平均20.87%）(n个=CD4总事件数的22）⁺T细胞。基于CD4门，根据CD127和/或CD25表达（CD4⁺CD127型^+/−CD25型^+/−和CD4⁺CD127型^+/−独立于CD25和CD25^你好常规T reg细胞）。将细胞收集到100%人AB血清（Cambrex）中，并用培养基（RPMI 1640/5%人血清）清洗一次，直到它们准备好进行抑制试验。分选的T调节细胞为95–98%的CD4⁺CD25型^你好典型产量为5–12×10⁵每种T细胞，而CD4⁺CD127型⁻CD25型⁺细胞的典型产量为0.9–1.2×10⁶纯度为98%。

人CD4⁺使用RosetteSep Human CD4从白血病患者（斯坦福大学血液中心）中通过阴性选择分离T细胞⁺T细胞鸡尾酒会（StemCell Technologies，Inc.）。0.75–1.25 × 10⁸CD4细胞⁺T细胞（FACS纯度>90%）清洗一次，计数，然后在10×10的FACS染色缓冲液（PBS+0.1%BSA）中重新悬浮⁶每毫升50毫升锥形管中。在添加1/90体积的Cy-5共轭抗CD4（BD Biosciences）和1/100体积的FITC-共轭抗CD25（DakoCytomation）抗体后，轻轻混合细胞悬浮液并在冰上培养45分钟。将冷FACS染色缓冲液添加到50 ml的体积中，将T细胞粒化并在20×10下重新悬浮⁶每毫升标记的T细胞在冰上培养45分钟，然后在DakoCytomation MoFlo高速细胞分选机上进行流动分选。分类门被设置为只包括那些CD25-特异性荧光（CD4）水平最高的事件⁺CD25型^你好细胞）或最低水平（CD4⁺CD25型^否定细胞）也在散点图的最低密度区域内。这相当于CD4总事件数的0.8%至1.4%⁺每个子集的T细胞。

使用RNA RT-PCR Miniprep试剂盒（Stratagene）中的总RNA分离方案从T调节细胞中分离出总RNA，并进行以下修改：在150μl裂解缓冲液中裂解100000个细胞。为了消化DNA，加入2 U DNA酶/μg核酸和苯酚/CCl_三（Sigma-Aldrich）用于纯化总RNA，然后进行乙醇沉淀。使用纳米滴ND 100（纳米滴技术）测量总RNA的数量。每种RNA样本100 ng用于通过两轮扩增方案进行靶标记。通过使用6 pMol的T7引物和3μg/μl的随机引物，从Affymetrix真核小样本制备中修改了该方案。

本研究共使用了16个人类HG-U133A基因芯片阵列（Affymetrix）。每个基因芯片杂交10μg片段cRNA在Affymetrix Fluidic工作站450和基因芯片扫描仪GCS2500（Hewlett-Packard公司）上进行处理。用MAS5.0（微阵列套件5.0版；Affymetrix）分析基因表达谱，并用于数据采集和归一化。通过选择四个阵列中的三个阵列中存在的基因来定义存在基因。激活组和对照组的所有现有基因的信号强度由Student’st吨测试。筛选出显著基因，P<0.05。通过比较分析MAS5.0生成“信号对数比”（SLR）和“增加”或“减少”调用，并用于计算组间的折叠变化。我们从16个成对比较中选择了9个，用于特定基因，这些基因在折叠变化>2.0时表现出增加或减少。在第二步中，使用微阵列显著性分析（SAM）分析当前基因的信号强度，并根据Student’st吨测试和折叠变化。最后的重要基因由上述两个步骤组合而成。使用GeneSpring 6.0软件（Silicon Genetics）生成二维层次集群。

根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN）分离RNA。对于cDNA合成，根据制造商的说明，使用SuperScriptIII逆转录酶和寡核苷酸（dT）12-18（Invitrogen）用cDNA转录试剂转录500 ng总RNA。使用从QIAGEN购买的引物和QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒，使用GeneAmp 7900序列检测系统（Applied Biosystems）实时测量基因表达。给定样本中基因的表达水平表示为2^-ΔΔCt其中ΔΔCT=[ΔCT_{（实验性）}]−[ΔCT_（中等）]和ΔCT=[CT_{（实验性）}]−[电流互感器_{（内务管理）}]. 数据显示并归一化为甘油醛磷酸脱氢酶（GADP）。

抑制试验在96周的圆形底部微量滴定板中进行。如图所示，添加来自与分选群体相同细胞源的100000个应答者PBMC、30000个分选细胞（基于CD25和/或CD127表达的七种不同分选亚型之一）、100000个同种异体辐照CD3贫化的PBMC。指示的应答器比率是指T调节细胞与应答器之间的比率，其中1个排序：1个应答器是30000个排序的细胞：100000个PBMC应答器细胞。APC由使用StemSep人CD3去除T细胞的异基因PBMC组成⁺根据制造商的建议（StemCell Technologies，Inc.）去除T细胞，并用40 Gy照射。细胞按以下顺序每孔50μl电镀：分选细胞、应答器和APC。没有向油井添加额外的刺激；然而，在每个孔中添加了额外的培养基，因此最终体积为200μl/孔。培养井周围的井中装满了PBS，以防止蒸发。将T细胞在37°C、5%CO中孵育7天₂.孵育结束前16 h，1μCi^三向每个孔中添加H-胸苷。使用Tomtec细胞采集器采集平板^三H-胸腺嘧啶核苷掺入量使用1450 microta Wallac Trilux液体闪烁计数器测定。

5 × 10⁴每个样本的T细胞用FACS染色缓冲液（PBS+0.1%BSA）清洗一次，然后再悬浮在100μl缓冲液中。添加1μl荧光偶联特异性抗体（1μg/百万T细胞），轻轻旋转T细胞并在冰上培养20分钟。向每个样品中添加500μl染色缓冲液，将T细胞制成颗粒，再悬浮在200μl缓冲液中，并在流式细胞仪上进行分析（Becton Dickinson，FACScalibur）。使用从BD Biosciences或eBioscienes（如有指示）获得的推荐程序进行细胞内染色。

人CD4⁺CD25型^你好如前所述，T调节细胞在体外扩增(37). 按照制造商的建议，使用染色质免疫沉淀分析试剂盒（Upstate Biotechnology）进行染色质固定和免疫沉淀。膨胀的人T调节细胞固定在1.1%甲醛中。蛋白质–DNA交联细胞颗粒重新悬浮在SDS-溶解缓冲液中（每10毫升⁸细胞），并在冰上孵育10分钟。对裂解液进行超声处理，将DNA剪切到200到1000个碱基对之间的长度，并在4°C下以13000转/分钟的速度离心10分钟，以去除碎片。将超声细胞上清液在含有蛋白酶抑制剂的ChIP稀释缓冲液中稀释10倍（Upstate Biotechnology）为了降低非特异性背景，用40μl蛋白a琼脂糖-50%浆液在4°C下搅拌，每1ml裂解液预先洗涤稀释的细胞上清液30分钟。使用对照兔Ig或亲和纯化兔多克隆抗人FoxP3抗体（西雅图Celtech Lt.的R.Khattri和F.Ramsdell赠送）免疫沉淀交联蛋白-DNA复合物。材料的交联被逆转，蛋白酶K被处理以从DNA中去除蛋白质。其余DNA用QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化，并用LMPCR（连接介导PCR）扩增，如前所述(50). 如前所述，在Affymetrix进行阵列杂交和分析(51). SYBR green qPCR用于验证阵列预测的结合位点。PCR反应的引物包括：IL-7R启动子：5′-引物，5′-CAGGGAATAGAA-3′；3′-引物，5′-TGTGTAGCCAGTGTATGAA-3′；IL-7R 2K上游：5′-引物，5′-TTTTGGGATTTCCTTGAACA-3′；3′-引物5′-TCTCTGGCATTTCAAACC-3′；IL-7R内含子4:5′引物，5′-GAGGTGCAGAGAGTAG-3′；3′-引物，5′-TGCATCACACTGCAAACAAA-3′；IL7-R内含子7和外显子8:5′-引物，5′-ACATGCTGGCAATTGTGA-3′；3′-引物，5′-TCTGGCAGTCCAGGAAACTT-3′。

作者感谢Q.Tang、H.Bour-Jordan和A.Abbas对手稿的技术援助和审查。我们也感谢A.Rudensky为FoxP3-GFP小鼠提供的帮助。

本研究得到了美国国立卫生研究院第P30 DK63720、U19 DK61934、AI0 48779号拨款的支持；青少年糖尿病研究基金会资助（JDRF 4-2005-1168，JDRF 1-2004-98）；以及Becton-Dickinson公司的资助。

作者没有相互冲突的利益。