α-突触核蛋白损伤巨自噬：与帕金森病的关系

帕金森氏病（PD）是第二常见的迟发性神经退行性疾病。帕金森病患者特有的肌肉僵硬、颤抖和运动迟缓被认为是由黑质多巴胺能神经元的细胞死亡引起的。有趣的是，帕金森病患者的认知和行为损伤表明黑质以外的大脑其他区域退化。

PD病理学的特征是形成称为路易小体的神经元内包涵体，主要由α-突触核蛋白组成。虽然PD在很大程度上是一种散发性疾病，但家族性疾病显示α-突触核蛋白是一种致病基因。α-突触核蛋白基因的突变，包括点突变和整个基因座的倍增，已被证明会导致家族性帕金森病，而帕金森病的严重程度增加和发病年龄提前已被报道与α-突触核蛋白剂量增加有关(Ross等人，2008年). 因此，野生型α-突触核蛋白可能是散发性帕金森病的毒性介质，对理解该病的分子发病机制至关重要。

α-突触核蛋白毒性的一个潜在机制源自对酵母过度表达该蛋白的优雅研究。这些研究表明，野生型α-突触核蛋白通过抑制Rab1的活性干扰了分泌途径。尽管研究表明，Rab1的过度表达在动物模型中挽救了α-突触核蛋白的毒性，但并没有表明哺乳动物细胞中的分泌途径受到这种蛋白的影响(Cooper等人，2006年;Gitler等人，2008年). 另一种非相互排斥的机制是α-突触核蛋白的修饰形式似乎影响伴侣介导的自噬（CMA；Cuervo等人，2004年). 在CMA中，一部分细胞质蛋白直接转移到溶酶体中，而不涉及囊泡中间产物或自噬体，即大自噬细胞器。虽然CMA对病理学的贡献非常可信，但它可能不是唯一受影响的蛋白质降解途径，尤其是因为LAMP2A/CMA-null小鼠的表型相对良性(Massey等人，2006年). 研究还表明α-突触核蛋白与26S蛋白酶体功能障碍之间可能存在联系(McNaught等人，2001年,2003;Snyder等人，2003年). α-突触核蛋白以三种常见形式存在：单体、二聚体和原纤维，人们认为原纤维形式过多会抑制体外泛素蛋白酶体的活性(McNaught等人，2001年,2003;Snyder等人，2003年;Zhang等人，2008年)尽管这些研究仍然存在争议，尤其是在体内(Dylick-Brenzinger等人，2010年).

大自噬是细胞降解胞浆内蛋白的主要溶酶体途径。大自噬（我们以后称之为自噬）与CMA不同，因为大自吞噬负责细胞质内容物的非特异性、大量降解，并且依赖于囊泡运输，而不是将底物直接导入溶酶体。当细胞在部分细胞质周围形成双层自噬体时，自噬开始。自噬体最终与溶酶体融合，其中的内容物被降解。这种途径从酵母到人类都是保守的，对一系列正常的生理功能至关重要。有巨自噬缺陷的小鼠出生后很快死亡，这种基因的神经元敲除导致神经退行性变并伴有包涵体形成(Kuma等人，2004年;小松等人，2005年). 自噬似乎影响与神经退行性变相关的多条途径，因为它是一系列胞质内聚集倾向蛋白（这是大多数神经退行性病的特征）降解的关键途径，也是功能失调线粒体（与许多疾病有关的细胞器，包括PD）的处置途径。一种与疾病相关的自噬底物是突变的亨廷顿蛋白（与亨廷顿病相关[HD]），当自噬受损时，具有突变亨廷顿聚集体的细胞比例增加(Ravikumar等人，2002年). 从这个意义上讲，具有突变亨廷顿蛋白聚集的细胞百分比可以作为自噬底物清除的敏感指标(Klonsky等人，2008年). 因此，我们认为自噬可能受到α-突触核蛋白的干扰，因为我们之前已经注意到，当细胞也过度表达α-突触核蛋白时，具有亨廷顿蛋白聚集体的细胞百分比增加(Furlong等人，2000年)这并不是由这两种蛋白质之间的结合引起的(Furlong等人，2000年).

我们证实了我们之前的观察结果，即α-突触核蛋白过度表达增加了具有亨廷顿蛋白聚集体的细胞百分比(图1 A;Furlong等人，2000年)自噬受损时发生的现象。我们进一步观察到α-突触核蛋白的过度表达也增加了另一种自噬底物p62的水平(图1 B).

直接检测自噬的标准方法是测量自噬体相关LC3的水平。微管相关蛋白1轻链3B（也称为LC3）的加工产生两种形式的LC3，可通过免疫印迹法识别。最初，LC3前体被裂解形成LC3-I，这是一种与自噬体无关的细胞质蛋白活性形式。LC3-I的进一步脂质化产生自噬体相关形式LC3-II，这是自噬体征征(Kabeya等人，2000年). 虽然LC3-I可以通过Western blotting检测到，但众所周知，LC3-I作为自噬指标在很大程度上是不可靠的，因为细胞裂解物中的蛋白质不稳定，而且它与自噬体无关。LC3-II水平（作为肌动蛋白或微管蛋白的功能）与自噬体数量相关；关于自噬方法的共识是，LC3-II应该与肌动蛋白/微管蛋白负荷控制有关，而不是与LC3-I有关（参见Klonsky等人[2008]进行详细讨论；Rubinsztein等人，2009年). 另外，LC3的免疫荧光染色可用于检测自噬体的形成。

LC3-II水平(图1C)以及LC3囊泡的数量(图1、D和E)与空载体转染的细胞相比，过度表达野生型α-突触核蛋白的细胞中，其表达量减少，这是野生型α-synuclein特有的，因为PD-相关α-synuglein突变体A53T和A30P对LC3-II水平没有影响(图S1 A). 尽管随着α-突触核蛋白的过度表达和Rab1a的敲除（参见Rab1a-调节自噬），囊泡尺寸有减小的趋势，但这在统计学上并不显著，但总是伴随着每个细胞囊泡数量的显著减少。LC3-II水平可能因LC3-II合成速率的变化或LC3-II降解速率的变化而发生变化。这些情况可以通过在巴非霉素A1饱和水平存在的情况下分析LC3-II水平来进行反褶积，巴非霉素A1阻止LC3-II降解，并允许对LC3-II形成率进行具体评估（如Rubinsztein等人[2009]). 我们证实，α-突触核蛋白引起的LC3-II水平下降是由自噬体合成受损引起的，当用巴非霉素A1处理过表达α-突触核蛋白的细胞时，LC3-II的水平也降低了(图1C). 与数据一致，α-突触核蛋白的敲除在有或无巴非霉素A1的情况下增加了LC3-II水平（图S1 B），并降低了具有亨廷顿蛋白聚集体的细胞的百分比（图S1C；我们在本实验中使用HeLa细胞，因为与神经元细胞相比，它们可以更有效地沉默siRNA）。过表达α-突触核蛋白的小鼠大脑中的LC3-II水平也降低，这表明我们在细胞培养中看到的影响存在于体内(图1，F和G). 我们的数据表明，α-突触核蛋白转基因对小鼠脑内LC3-II水平的影响具有剂量依赖性。我们拟合了转基因剂量（0、1或2）对LC3-II水平影响的剂量依赖性回归模型，并发现统计证据支持这种关联（P=5.35×10⁻³). 为了分析少量样本，我们还进行了排列测试，确认了相关性P=0.89×10⁻³（789/100000个排列的检验统计量比原始检验中观察到的要大）。无法评估小鼠脑内α-突触核内自噬体数量的减少是否是由于自噬小体向溶酶体的形成减少或递送增加所致。然而，我们在小鼠大脑中看到的LC3-II水平的降低与我们在α-突触核蛋白过度表达的细胞中观察到的自噬体形成的明确减少一致。

复眼黑腹果蝇由许多小眼组成，每个小眼由八个感光神经元组成，这些感光神经元具有被称为杆状体的聚光部分，其中七个可以通过使用假瞳孔技术的光学显微镜观察到(Franceschini和Kirschfeld，1971年). 表达具有120个多聚谷氨酰胺重复序列的突变亨廷顿蛋白片段的苍蝇感光器表现出感光器退化，而在表达具有23个多聚丙胺重复序列的野生型片段的苍苍中没有观察到这种情况(Jackson等人，1998年). HD苍蝇的神经退化是进行性的，并且随着时间的推移，每个小眼座中可见的杆状体数量减少(Jackson等人，1998年). 该苍蝇模型可用于分析神经变性调节剂。当自噬受损时，细胞会积聚易于聚集的胞质内蛋白，并更容易受到凋亡损伤的影响(Ravikumar等人，2006年). 我们之前已经证明，用遗传或化学自噬抑制剂治疗突变的亨廷顿蛋白表达苍蝇会增加苍蝇眼睛内的神经退化(Ravikumar等人，2005年,2008). 如果α-突触核蛋白抑制自噬，那么表达突变型亨廷顿蛋白的神经元作为一种模型聚集倾向的有毒蛋白，在与α-突触核蛋白共表达时会更快退化。与我们的假设一致，野生型α-突触核蛋白的存在增强了HD突变的毒性(图1 H). 虽然我们不能排除α-突触核蛋白也通过自噬非依赖性途径增强突变型亨廷顿蛋白的毒性，但我们的细胞生物学数据表明，对自噬的影响是重要的因素。

早期对酵母菌的研究发现，自噬可能依赖于分泌途径的正常功能(Ishihara等人，2001年;Hamasaki等人，2003年;Reggiori等人，2004年). 鉴于先前的研究结果表明，α-突触核蛋白通过破坏Rab1a体内平衡抑制酵母和体外分泌(Cooper等人，2006年;Gitler等人，2008年)，我们认为，在ER到高尔基体转运水平上，α-突触核蛋白引起的分泌途径缺陷可能是我们在哺乳动物细胞中观察到的自噬缺陷的基础。为了研究α-突触核蛋白对哺乳动物细胞内质网向高尔基体转运的影响，我们使用了一种药物控制的分泌系统，该系统能够敏感地测量组成性分泌的变化。该试验表明，野生型α-突触核蛋白的过度表达对哺乳动物细胞的组成性分泌产生适度但可重复的抑制作用(图2 A). 过度表达α-突触核蛋白的细胞也显示高尔基体碎片增加(图2、B和C)通常由分泌缺陷引起的表型（例如，Rab1a siRNA敲除；图S2 A). 与这些发现一致，与健康对照组相比，尸检PD脑切片中观察到高尔基体碎片增加(Fujita等人，2006年).

我们测试了Rab1a敲低是否调节自噬。由于没有已知的Rab1a活性的特异性抑制剂，我们使用敲除实验来模拟Rab1a功能的丧失。在bafilomycin A1存在和不存在的情况下，Rab1a的siRNA敲除降低了LC3-II水平(图3 A). Rab1a敲除增加了具有突变亨廷顿蛋白聚集体的细胞百分比(图3 B). Rab1的一种组成活性形式抑制了突变体亨廷顿蛋白的毒性果蝇属光感受器(图3 C)而显性阴性Rab1增强了突变亨廷顿蛋白片段的毒性(图3 D). 因此，Rab1a缺乏调节自噬并模拟α-突触核蛋白过度表达对自噬和相关表型的影响。值得注意的是，α-突触核蛋白的过表达不会影响细胞或小鼠脑裂解物中Rab1a蛋白水平，这与α-突触核蛋白对Rab1a活性的影响而不是蛋白水平的影响一致（图S2 B）。

鉴于Rab1a在分泌中的作用，我们想确定Rab1a是否独立于一般分泌调节自噬，或者自噬是否实际上取决于分泌途径的正常功能，这与早期酵母研究有关(Ishihara等人，2001年;Hamasaki等人，2003年;Reggiori等人，2004年). 了解这种差异可能会提供线索，说明α-突触核蛋白引起的自噬缺陷是否是分泌缺陷的一般后果，或者Rab1a对自噬的抑制是否可以与一般分泌缺陷分离，这表明Rab1a在自噬调节中具有特殊作用。为了开始解决这个问题，我们使用RNAi降低Rab1a效应器（Giantin和VDP[囊泡锁蛋白115]）、对Rab1a分泌至关重要的早期分泌蛋白（Sar1A和-B）以及Rab1b（Rab1的一种替代亚型，也参与早期分泌）的蛋白水平。在敲除这些蛋白后，我们分析了它们的缺失对分泌和自噬的影响，以更密切地观察这两条途径的相互作用。敲除Rab1a、VDP、Giantin、Sar1A和-B均部分抑制构成性分泌(图4 A)以诱导分泌80分钟后分泌的蛋白质百分比来衡量。Rab1b（似乎将不同的囊泡亚群输送至Rab1a；Allan等人，2000年;Alvarez等人，2003年)抑制分泌的程度与Rab1a、Giantin和VDP相似。与Rab1a一样，已知Rab1a效应物Giantin和VDP以及Sar1A和-B的敲除降低了LC3-II水平(图4 B)，增加了含有亨廷顿蛋白聚集体的细胞百分比(图4C)增加了p62的积累(图4 D). 出乎意料的是，Rab1b的敲除对自噬产生了相反的影响。Rab1b RNAi增加LC3-II(图4 E)水平，降低含亨廷顿蛋白聚集体的细胞百分比(图4 F)减少p62的积累(图4 G).

尽管人们对Rab1a和Rab1b的不同功能知之甚少，但它们在自噬背景下的作用的明显差异令人惊讶。这导致我们测试了另一种功能相关的Rab，Rab2。Rab2的特征甚至不如Rab1b，它在内质网-高尔基体和高尔基体内运输的几乎所有方面都发挥着作用(蒂斯代尔，1999年). 与Rab1b一样，Rab2的敲低增加了稳态LC3-II(图4、D和E)水平，降低含亨廷顿蛋白聚集体的细胞比例(图4 F)，并降低p62水平(图4 G). 虽然与Rab1a类似，Rab1b的敲低抑制了分泌，但它实际上减少了自噬底物的聚集。有趣的是，化学数据进一步证实了支持自噬功能独立于分泌功能的证据，这些数据表明，众所周知的自噬诱导剂海藻糖(Sarkar等人，2007年)，导致分泌的部分阻断（图S2 C）。总的来说，这些数据为Rab1在自噬调节中的特定作用提供了有力证据，而自噬的调节独立于一般分泌对自噬产生的任何影响。这些数据表明，在不降低自噬体合成的情况下，某些分泌途径会受到损害，而由Rab1a及其效应器特异性调节的途径对自噬至关重要。

为了进一步证实α-突触核蛋白通过Rab1a作用于自噬的假说，我们测试并证实了Rab1a的过度表达可以挽救α-突触核蛋白过度表达导致的自噬小体丢失。与对照条件相比，α-突触核蛋白的过度表达显著降低了囊泡数。Rab1a-CFP的共表达将囊泡计数的减少恢复到控制水平(图5，A和B).

我们已经证明，α-synuclein导致分泌和高尔基体缺陷，与Rab1a稳态破坏一致，α-sunuclein和Rab1a在自噬体合成中导致类似和特异的缺陷，而Rab1b可以拯救α-synuglein对自噬的抑制作用。这表明α-突触核蛋白通过Rab1a抑制自噬。为了确定α-突触核蛋白和Rab1a对自噬作用的潜在机制，我们分析了自噬体合成的关键步骤。Rab1a敲除或α-突触核蛋白过度表达均未影响自噬信号通路中的关键参与者，如mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）活性(图S3 A).

我们接下来关注的是Atg9，因为它是唯一已知的跨膜自噬蛋白之一（在其转运和糖基化中涉及分泌途径），并且是自噬体生物发生所必需的。Atg9定位于TGN并与部分LC3阳性自噬体共定位。雷帕霉素诱导自噬或饥饿导致Atg9从TGN移向自噬体（图S3 B），导致Atg8与TGN标记物共定位减少，Atg9与自噬体共定位增加（图S3C；Young等人，2006年). Rab1a敲除和α-突触核蛋白过度表达不会明显影响Atg9的糖基化(图S4 A). 然而，这两种扰动都导致Atg9从其正常的核周位置（与TGN标记p230共定位）重新定位到细胞内的弥散分布(图6 A和图S4 B）。这种定位错误，在α-synuclein过度表达的细胞中或Rab1a被敲除的细胞中，也表现为与Atg9共定位的LC3小泡比例较低，与LC3共定位的Atg9结构较少（通过使用Mander系数控制LC3小囊数量减少后；图6，C–E). 这种定位错误并不是自噬抑制剂的一般特征，因为用LY290042（磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂；Young等人，2006年)、3-甲基腺嘌呤或巴非霉素A1，它们都不同于雷帕霉素（显示为Atg9运动的阳性对照；图S4 C）。此外，在敲除Rab1b和Rab2后，未发现Atg9共定位的这种特征性改变，这两种基因都增加了Atg9和LC3的共定位（图S4、D和E），并降低了Atg8与p230的共定位。这些数据与我们早期的发现一致(图4，E–G)表明Rab1b和Rab2敲低增加了自噬。总之，这些数据表明，Rab1a敲低和α-突触核蛋白过表达的作用不仅相似且相对特异，而且Rab1a敲低对自噬的影响不仅仅是由组成型分泌或高尔基体结构的一般性紊乱引起的，正如Rab1b和Rab2的不同作用所表明的那样。

由于对Atg9对自噬体合成的调节知之甚少，我们更具体地研究了α-突触核蛋白和Rab1a对ω体形成的影响。omegasome是一种新的特征标记，被认为是形成自噬体的前体。表达GFP标记的双FYVE结构域蛋白（DFCP1）的细胞可以可视化地形成ω。DFCP1上的双FYVE结构域在ER相关新生自噬体的拟定形成部位与磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI（3）P）结合(Axe等人，2008年). PI（3）P在自噬中起关键作用，抑制PI（3(Kihara等人，2001年;铃木等人，2007年). DFCP1-GFP阳性囊泡，称为omegasomes，在用已知的自噬诱导剂处理后增加，并已被证明与LC3和Atg5共定位。因此，表达GFP标记的DFCP1的细胞可以可视化自噬体形成的早期事件(Axe等人，2008年).

在基础条件下，Rab1a的敲除和α-突触核蛋白的过度表达降低了ω小泡的数量(图7，A–D). Rab1a的过度表达能够挽救α-synuclein过度表达导致的ω体形成缺陷，并将ω体水平增加到接近对照条件的水平(图7、E和F). 有趣的是，Rab1a过度表达可使omegasome计数高于正常基础状态，但不能使α-突触核蛋白表达细胞中LC3小泡的形成高于基础水平。omegasome向功能性LC3阳性自噬体的转变可能是一个潜在的速率减缓步骤，不能简单地通过增加omegasom的形成来克服。

由于α-突触核蛋白和Rab1a似乎通过Atg9定位错误影响自噬，我们还测试了Atg9敲除对ω体形成的影响，以确定Atg9是否作用于ω体生成的上游。与Rab1a敲除和α-突触核蛋白过度表达一样，Atg9敲除在基础条件下减少了ω小体和自噬小体的形成，表明Atg9在这些过程的上游起作用(图7、A、B和G). 因此，这些数据与α-突触核蛋白损害Rab1a活性的模型相一致，后者反过来干扰Atg9功能，以在生物发生的早期减少自噬体的形成。

我们的数据表明，α-突触核蛋白的过度表达会损害大细胞自噬。这提供了α-突触核蛋白拷贝数突变导致PD的机制。因为散发性PD也与α-突触核蛋白的积累有关，我们的数据可能具有更广泛的意义。

我们的发现似乎针对野生型α-突触核蛋白，因为PD-相关点突变体A53T和A30P对LC3-II水平没有影响（图S1 A）。这可能是因为A53T和A30P与野生型蛋白相比对自噬没有影响或有不同的影响。或者，这些突变体确实以与野生型蛋白质相似的方式损害自噬，但其作用被已知的CMA抑制所掩盖(Cuervo等人，2004年)导致自噬体形成的代偿性增加。

我们发现，野生型α-突触核蛋白在体外和体内的过度表达抑制了自噬体的合成，这是由一系列不同的特异性检测所确定的。这些分析表明，ω组形成减少，LC3-II脂质化减少，LC3小泡形成受损，自噬底物积累（突变的亨廷顿蛋白和p62）。根据以前的数据来看，α-synuclein影响Rab1a功能(Cooper等人，2006年)，我们有兴趣确定α-突触核蛋白是否通过Rab1a对自噬起作用。我们发现，Rab1a的敲除通过减少omegasome形成、降低LC3-II水平和增加自噬底物，模拟了α-synuclein过度表达的影响。重要的是，Rab1a的表达能够挽救α-突触核蛋白对ω小泡和LC3小泡形成的抑制作用。

我们认为，α-synuclein和Rab1a通过启动自噬体合成的早期步骤控制自噬，因为发现Atg9因α-synuglein过度表达和Rab1基因敲除而定位错误。Atg9敲除本身降低了omegasome形成和LC3-II水平，表明Atg9控制着omegasomeformation上游自噬体形成的一个步骤。

这些发现对于理解PD的分子发病机制和进一步了解自噬的调控具有重要意义。我们的数据确定了Rab1a在自噬调节中的新作用。我们观察到的影响不仅仅是由内质网-高尔基体运输的一般性损伤引起的，因为其他介导这一步骤的Rab在被击倒时不会损害自噬。此外，强健的自噬诱导剂海藻糖(Sarkar等人，2007年)似乎减少了分泌（图S2 C），表明大量分泌可以从自噬诱导中解偶联。类似地，Atg9糖基化与Rab1a敲除之间没有变化，这表明Atg9的转运，至少从内质网到高尔基体，没有明显受损。我们的数据与通过Rab1a（但不是Rab2或Rab1b）贩运的其他分子调节Atg9贩运的模型一致，后者反过来调节omegasome的形成。

有趣的是，在酵母中，高尔基体相关的COG（保守寡聚高尔基体）复合物对自噬体组装很重要，似乎也影响Atg9的运输(Yen等人，2010年). 这将有助于评估哺乳动物细胞中的这一过程，并测试分泌途径中后期步骤的特定扰动是否影响哺乳动物细胞的自噬。然而，重要的是要重申，我们的数据表明，某些分泌途径（如Rab1b和Rab2）可以在不减少自噬体合成的情况下受损，而Rab1a及其效应物特异性调节的途径对自噬至关重要。因此，Rab1a通过特定的Rab1a-相关分泌途径影响自噬，或者可能通过Rab1a的一种新颖的分泌依赖性功能发挥作用。

虽然我们的数据表明，特定的分泌相关成分调节自噬，但最近的出版物发现了一种有趣的情况，即自噬调节一种特殊形式的分泌。自噬体通过绕过液泡并与质膜融合，在各种酵母的饥饿条件下参与酰基辅酶A结合蛋白（AcbA）的分泌。这一过程涉及高尔基相关蛋白（GRASPs）、自噬蛋白、质膜SNARES、内胚小室和过氧化物酶体活性(Duran等人，2010年;Manjithaya等人，2010年). 这些研究增加了分泌途径和非针孔溶酶体途径相互作用的可能性。尽管我们的研究结果涉及自噬体-溶酶体途径和Rab1a的分泌依赖性功能，但进一步阐明哺乳动物细胞内分泌和自噬途径的相互作用以及新的Rab1特异性自噬调节如何适应这些途径的交叉点将是很重要的。

α-突触核蛋白过度表达对Rab1a功能的损害将对两种分泌途径产生累积效应，如图2（A–C）和之前(Cooper等人，2006年)以及自噬。虽然我们观察到的α-突触核蛋白对哺乳动物细胞分泌的影响是可重复的和一致的，但与我们观察到α-突触核蛋白和Rab1a对自噬的影响相比，这些影响似乎相对较小。累计而言，这些分析显示自噬体合成减少了30-50%。虽然这并不代表自噬的完全阻断（这将是致命的；Tsukamoto等人，2008年)，一个我们观察到的或更小的部分大小的阻滞，很可能在几十年内对有丝分裂后的神经元产生重大影响。值得注意的是，α-突触核蛋白水平的降低会增强自噬。因此，这种蛋白水平即使很小的增加（或减少）也可能会调节自噬。部分抑制分泌途径和自噬的累积效应可能分别解释多巴胺分泌缺陷、蛋白质积累和细胞死亡。

总的来说，这种情况似乎代表了一个具体的例子，说明了一种特定的易于聚集的蛋白质如何破坏整个细胞的蛋白质平衡，该模型由Gidalevitz等人（2006年）在另一种疾病背景下。在这种情况下，罪魁祸首α-突触核蛋白破坏了自噬，自噬是清除易聚集胞质内蛋白的主要途径，而这反过来又增加了此类蛋白的浓度并增加了其聚集的可能性。然而，减少自噬清除率的预测结果将具有多效性效应。除了聚集倾向的蛋白质外，细胞在清除功能失调的线粒体方面也没有那么有效(Twig等人，2008年)并且将增加对某些凋亡损伤的易感性(拉维库马尔等人，2006年); 这些都是与PD有关的过程(图7 F;库克森和范德布鲁格，2008年). 因此，野生型α-突触核蛋白引起的自噬抑制可能为帕金森病中许多明显不相连的细胞病理提供了统一的机制。有趣的是，当这些途径之一受到干扰时，可能存在CMA和大自噬的代偿调节(Martinez-Vicente等人，2008年). 然而，如果有人认为野生型α-突触核蛋白抑制了宏观自噬和CMA(Martinez-Vicente等人，2008年)，这可能是特别有害的。

重要的是，我们提出的α-突触核蛋白对自噬的抑制作用机制进一步加深了我们对该疾病的理解(图8). 虽然α-突触核蛋白对早期分泌的抑制可能解释了PD中出现的多巴胺能缺陷，但这并不能充分解释PD内含物的形成和细胞死亡特征。原则上，α-突触核蛋白基因座的倍增导致α-突突核蛋白蛋白水平的增加将抑制自噬。抑制自噬会增加聚集倾向蛋白的积累，并使细胞对促凋亡攻击敏感。聚集和凋亡增加是PD的特征，因此，α-突触核蛋白过度表达对自噬的抑制可能进一步解释PD的病理特征。总之，α-联核蛋白抑制自噬和分泌的能力可能是神经退行性变的强大动力。

将人神经母细胞瘤细胞（SKNSH）、人宫颈癌细胞（HeLa）和人胚胎肾细胞（HEK293）保存在补充有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素/链霉素和2 mM的DME中我-37°C和5%CO条件下的谷氨酰胺（Sigma-Aldrich）₂DFCP1-GFP–表达细胞系以800µg/ml的浓度进行筛选，是N.T.Ktistakis（英国剑桥Babraham研究所）的礼物。

根据制造商的说明，使用80 nM siRNA，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）将构建物和siRNA转染到OptiMeM（Invit罗gen）中，并与对照siRNA（非靶向SMARTpool；Thermo Fisher Scientific）进行比较。野生型α-突触核蛋白构建物以1.5微克/孔、httQ74构建物以0.5微克/井、LC3-番茄以0.2微克/微孔、Rab1a-CFP（之前描述的构建物；Maier等人，2009年; 奥地利维也纳医科大学H.Sitte的礼物），每孔1.5微克，tomato-p62，0.75微克，DsRed，每孔0.5微克。

在400 nM的条件下使用巴非霉素A1 4小时（密理博）。3-甲基腺嘌呤（Sigma-Aldrich）在10 mM下使用16 h。雷帕霉素在0.5µM下使用4 h。在HBSS中进行饥饿实验4 h。

EGFP-httQ74聚集通过直接免疫荧光检测，而httQ74-HA聚集通过免疫染色检测（初级HA抗体[1:500；Covance]和抗小鼠Alexa Fluor结合二级抗体[1:1000；Invitrogen]）。对含有聚集物的转染细胞比例进行评分（每张盖玻片约200个细胞）。每三个独立实验进行三次盲法实验。聚集分析的统计数据以原始数据95%置信区间的优势比（每种情况下聚集细胞核的比率）进行计算。使用SPSS 6.1版（SPSS Inc.）中的通用对数线性分析，通过无条件逻辑回归分析确定比值和p值。

通过标准SDS-PAGE技术评估蛋白质水平。主要抗体包括抗EGFP（Takara Bio Inc.）、抗HA（12CA5；Covance）、抗Rab1a、抗Atg9（均为Abcam）、抗tubulin和抗LC3（Novus Biologicals）。在ImageJ（美国国立卫生研究院）软件中对正常ECL开发技术和LI-COR Odyssey（BD）进行蛋白质水平的Western blotting定量。

细胞生长在盖玻片上，并在4%多聚甲醛中固定10分钟，然后用−20°C甲醇渗透4分钟。对于使用httQ74-HA的聚集实验，使用0.5%Triton X-100在PBS中渗透细胞。使用PBS中4%的山羊血清（Sigma-Aldrich）进行阻断，并使用一级和二级缓冲液。将盖玻片放置在4°C的初级抗体中过夜。次要抗体是结合Alexa Fluor抗体（Invitrogen）。除抗LC3（纳米工具）外，用于免疫印迹的所有初级抗体均用于免疫染色。

共聚焦显微镜（63×NA 1.4 Plan-Apochromat油浸透镜；LSM510 META；Carl Zeiss，Inc.）以及LSM5103.2版软件（Carl Zess，Inc.）用于荧光共聚焦显微镜，包括用Alexa Fluor–共轭二级抗体或荧光标记蛋白进行免疫荧光染色。除了涉及DFCP1-GFP HEK293 omegasome细胞系的实验外，所有共聚焦图像都是用63×油浸透镜拍摄的，其中使用了40×油浸透镜。对固定在盖玻片上的细胞进行显微镜检查。盖玻片安装在Prolong Gold防褪色试剂中（使用DAPI；Invitrogen）。ImageJ和Photoshop（Adobe）用于共焦图像的进一步分析和处理（下一节将讨论共焦分析和图像处理软件的使用细节）。使用显微镜（Plan-Apochromat 60×NA 1.4油浸透镜；Eclipse E600；Nikon）进行聚集计数和高尔基体碎裂定量。

内源性蛋白免疫染色后，使用LSM510 META共焦显微镜（63×NA 1.4 Plan-Apochromat油浸透镜）和LSM5103.2版软件对Atg9与高尔基体（p230）和LC3的染色进行成像。在每个实验条件下，每幅图像平均拍摄5个细胞的10张图像。每个实验都至少进行两个独立的实验。在整个采集过程中，曝光设置保持不变。在z堆栈中对细胞进行成像，并通过JaCoP插件对图像进行分析(博尔特和科德利埃，2006年)在ImageJ软件中。Pearson和Mander（原始非阈值）系数用于报告共定位。学生的t吨测试在Excel（Microsoft）中进行，以确定共定位系数的统计显著性。显示的图像是使用ImageJ和Photoshop软件的z堆栈投影或代表性图像的单个平面。

矢量（pC₄秒₁-FM公司₄-FCS-hGH）编码药理学调控的报告结构，从ARIAD Pharmaceuticals获得(Rivera等人，2000年). 修改了结构，以便在信号序列和第一个FM之间的帧内克隆EGFP₄聚合域。然后将报告构建物亚克隆到逆转录病毒表达载体pQXCIP（Takara Bio Inc.）中。通过病毒转染HeLa细胞生成了一个稳定的细胞系（称为C1），该细胞系表达报告构建物。

对于siRNA实验，如前所述，使用寡病毒胺（Invitrogen）将OnTargetPlus siRNA寡核苷酸（最终浓度100 nM；Thermo Fisher Scientific）转染C1细胞(莫特利等人，2003年). 在过度表达实验中，使用HeLaMonster（Mirus）将α-synuclein–CFP或CFP转染到C1细胞96小时，然后检测分泌情况。Brefeldin A是一种已知的分泌抑制剂，以2µg/ml的浓度作为本试验的对照。

为了评估组成性分泌，通过在37°C和5%CO中用1µM AP21998（ARIAD Pharmaceuticals）培养C1细胞来启动稳定表达的GFP–生长激素的分泌₂将细胞放在冰上，使其停止分泌，并将细胞与胰蛋白酶-EDTA溶液（PAA Laboratories）在4°C下孵育2小时，将其从培养皿中分离出来。使用添加FCS的DME对胰蛋白酶进行猝灭，然后使用FACSCalibur流式细胞仪（BD）在0和80分钟对样品进行EGFP荧光分析。使用7-氨基放线菌素D排除死细胞。为了分析α-突触核蛋白过度表达实验（需要CFP和GFP荧光检测），样品在Cyan ADP（Beckman Coulter）上进行分析。

为了测量GFP的分泌量，每个siRNA寡核苷酸或构建物被转染两次。第一个样本用于初始时间点（0分钟），第二个样本用于最终时间点（80分钟）。测量每个样品的平均荧光，并使用FlowJo软件（Tree Star，Inc.）计算细胞中剩余的GFP量。

使用Excel软件对Student’st吨测试（过表达实验）和PRISM软件（GraphPad software，Inc.）用于单向方差分析（ANOVA；siRNA实验）。80分钟后分泌蛋白的百分比是通过将80分钟时的GFP荧光除以0分钟时的绿色荧光蛋白荧光来确定的。对于α-突触核蛋白和brefeldin A，该比率被归一化为空载体（CFP）。

在过表达α-突触核蛋白-GFP或EGFP的细胞中使用抗GM130抗体对高尔基体进行免疫染色。破碎的高尔基体被认为是分散的、非凝聚的GM130染色，而非破碎高尔基体则被认为是凝聚的、核周的和带状的GM130着色。用高尔基体碎片转染细胞的百分比在至少200个细胞的盲法实验中进行计数，共进行三次。

对适当基因型的后代进行假瞳孔分析，这些后代是由基因型的处女杂交产生的elav-GAL4型^155元; gmr-Htt（外显子1）Q1204.62(Jackson等人，1998年)苍蝇表达野生型α-突触核蛋白(无人机系统-α-同步;费尼和本德，2000年)和表达组织学活性Rab1的苍蝇(年¹P（P）{UASp-YFP.Rab1.Q70L}CG3638^第12页w个*;Zhang等人，2007年)或显性负Rab1(年¹w*；P（P）{UAST-YFP.Rab1.S25N}mei-S332⁰⁴;Zhang等人，2007年).

作为衍生飞行系的对照，同基因的处女w个¹¹¹⁸线路(Ryder等人，2004年)或者泛神经驾驶员elav-GAL4型^155元与每个转基因系的雄性杂交以产生后代，以确认除gmr-Htt（外显子1）Q120导致神经退化。同样的处女与男性杂交y w；gmr-Htt（外显子1）Q1204.62评估突变体亨廷顿蛋白引起的神经退行性变率。

在25°C下进行苍蝇杂交和实验。在相同的时间和条件下进行所有单独实验的杂交。使用配对的Student’st吨使用五到七个独立实验的数据进行测试，每个实验基于每个基因型的约10个个体，每个基因型都有15个小蜂被打分。我们感谢M.Feany（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）、G.R.Jackson（加利福尼亚大学洛杉矶分校医学院）和Bloomington果蝇库存中心果蝇属股票。

M7α-synuclein小鼠是V.M.-Y.Lee（宾夕法尼亚大学，费城，PA）赠送的礼物。为了产生三种可能的小鼠基因型，M7纯合子与C57BL/6J杂交，F1杂交产生F2上的三种基因型（+/+、M7/+和M7/M7）。所有实验均使用F2小鼠。所有程序均按照内政部和地方道德委员会的批准进行。

在所有实验中使用F2小鼠。通过实时PCR从耳唇DNA中对F2小鼠进行基因分型。通过Western blotting验证α-突触核蛋白的表达水平。半脑（22–23周龄男性；n个分别=3）在裂解缓冲液中均质（0.5%Triton X-100和50 mM Tris HCl，pH 7.4，补充完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche]）。匀浆在4°C下以13200 rpm离心。去除上清液，通过SDS-PAGE评估LC3-II和微管蛋白水平。使用ImageJ软件对免疫印迹进行密度分析。野生型小鼠的平均值设置为100%，误差条表示SEM。

对于剂量依赖性测量，使用R进行回归分析。为了验证α-突触核蛋白转基因剂量与LC3-II水平之间的相关性，我们使用了排列检验。我们将小鼠随机分配到不同的基因组，测试关联性，并存储测试统计数据。我们重复了10万次，计算了置换测试的p值，测试统计的比例大于原始分析中观察到的比例。

除非另有说明，否则所有数据均为代表性实验的平均值。除非另有说明，否则所有实验均进行了三个独立实验。组间单次比较的统计显著性由双尾、非配对、Student’st吨在Excel软件中执行的测试。使用比值比（SPSS软件；SPSS，Inc.）确定聚集实验的显著性。聚集分析的统计数据以原始数据95%置信区间的比值比（每种条件下转染细胞与聚集物的比值比）进行计算。使用SPSS 6.1版中的一般对数线性分析，通过无条件逻辑回归分析确定比值和p值。为了简化数据表示，将聚集实验的柱状图表示为具有代表性的实验中聚集百分比的平均值，并使用平均值的SEM。在PRISM软件中，使用Bonferroni或Dunnett的多重比较事后检验，通过单向或多重比较方差分析确定两个以上组之间比较的统计显著性。

图S1显示野生型α-突触核蛋白调节自噬。图S2显示，α-突触核蛋白通过抑制Rab1a稳态影响自噬。图S3显示了Atg9共定位事件与自噬诱导的变化。图S4显示Atg9定位对自噬很重要。

我们感谢H.Sitte的Rab1a-CFP构建。我们感谢M.Feany、G.R.Jackson和布鲁明顿果蝇库存中心果蝇属M7α-突触核蛋白小鼠的库存和V.M.-Y.Lee。我们感谢N.T.Ktistakis向我们发送DFCP1-GFP HEK293 omegasome细胞系。我们还要感谢J.Cooper（英国剑桥大学）在统计方面的帮助，以及M.Gratian和M.Bowen（剑桥大学）对显微镜技术的帮助。

导致这些结果的研究得到了威康信托基金（D.C.Rubinsztein高级研究员）、医学研究委员会（MRC；D.C.Rupinsztei、C.J.O'Kane的项目拨款，A.A.Peden的S.Brown和职业发展奖）、威康信托/MRC（D.C.鲁宾斯泰因的神经变性战略奖）的资助，海外研究生奖学金和剑桥海外信托基金（授予A.R.Winslow）以及欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013），授予协议编号241791（MEFOPA）。