疏水结构域在小窝蛋白-1靶向脂滴中的作用

脂滴（LD）存在于大多数真核细胞的细胞质中，由富含三酰甘油酯和甾酯的核心组成，核心被磷脂单层包围(Londos等人，1999年;Zweytick等人，2000年;墨菲，2001). LD被认为是通过一种不寻常且特征不佳的机制从ER中萌芽而形成的。首先，中性脂质（在内质网膜中合成）积聚在双层的中心并形成圆盘。接下来，椎间盘在扩大的过程中膨胀到细胞质中，并最终从内质网中萌芽为乳酸脱氢酶，在此过程中获得内质网衍生的磷脂单层。

虽然已知疏水性LD核心中没有蛋白质，但有几个蛋白质是针对LD表面的。对其中大多数的功能知之甚少。其中最为人们所了解的是油素，它是某些植物种子中丰富的蛋白质，可防止干燥过程中油体（植物LD）的聚合(黄，1992;墨菲，2001). 当在动物细胞中表达时，油素以油体为靶点，这表明靶向机制在界之间是保守的(霍普等人，2002年). 与油素有关的钙是钙²⁺-植物和真菌中功能未知的LD结合蛋白(Chen等人，1999年;Naeste等人，2000年). 动物细胞中最具特征的LD蛋白是紫苏素，它覆盖在脂肪细胞和类固醇生成细胞的LD表面。Londos等人（1999年）研究表明，紫苏皂苷的磷酸化状态调节荷尔蒙敏感脂肪酶进入LD表面，并调节脂质储存的动员(Tansey等人，2003年). 与该模型一致的是，在血脂缺乏的小鼠中，脂肪细胞中脂质代谢的调节受到干扰(Martinez-Botas等人，2000年;Tansey等人，2001年). 一种相关的LD蛋白，即脂肪细胞分化相关蛋白（ADRP）或亲脂蛋白，广泛分布于哺乳动物细胞中(Brasaemle等人，1997b). 丙型肝炎病毒（HCV）和相关GB病毒B（GBV-B）的核心蛋白也至少部分针对LD(Barba等人，1997年;霍普等人，2002年). 其他蛋白质，如脂肪细胞中对激素敏感的脂肪酶，可以与LD短暂结合(Egan等人，1992年).

LD蛋白分为两类结构。第一类包括紫苏素和ADRP。橄榄脂没有长的疏水结构域，由游离多糖体构成(Brasaemle等人，1997年a)和可能直接从胞浆靶向LD表面。在紫苏素或ADRP中都无法识别简单的离散LD靶向基序(Garcia等人，2003年;McManaman等人，2003年;中村和藤本，2003年;Targett-Adams等人，2003年). 相反，两种紫苏素A的LD靶向(Garcia等人，2003年)和ADRP(Targett-Adams等人，2003年)包含冗余的不连续序列。

第二类LD蛋白，包括油素和钙调素，是“完整的”LD蛋白。这些蛋白质具有独特的拓扑结构。亲水NH₂-和COOH末端细胞质结构域位于中心疏水结构域的侧面，该疏水结构域长度范围为～30到>70个残基（对于油素而言），并且推测嵌入疏水LD核心。油素疏水结构域的结构存在争议。它可以假定为β链构象，与相邻链相互作用形成平行的β片(Li等人，1992年,2002)，或可能包含两条反平行β链之间的中心紧弯(黄，1992;Tzen等人，1992年)，或者可以是α-螺旋的(莱西等人，1998年). HCV和GBV-B核心蛋白也包括在完整LD蛋白类中(霍普等人，2002年). 这些蛋白质的中心结构域相当疏水，尽管它们含有几个带电荷的残基。

已知油素的正确靶向取决于信号识别粒子和Sec61转座子(Beaudoin等人，2000年;Abell等人，2002年). 因此，完整的LD蛋白可能以共翻译方式插入内质网膜，并在内质网双层中扩散，以接触新生LD的表面，而这些LD仍嵌入内质网。只有当这些蛋白质在膜腔侧缺乏亲水结构域时，才有可能进入LD表面，因为这些结构域无法容纳在疏水性LD核心中。正如预期的那样，没有已知的跨膜LD蛋白。整合的LD蛋白高度集中在LD表面，可能反映了相对于ER对LD表面的高亲和力。

中心疏水区是油素和HCV核心的LD靶向所必需的(霍普和麦克劳克兰，2000年;霍普等人，2002年). 此外，油素中还存在一个“Pro knot”基序，由长疏水结构域中心的三个紧密排列的Pro残基组成(Tzen等人，1992年)并且是其LD目标所必需的(Abell等人，1997年). 钙调素中也存在类似的基序(Naeste等人，2000年). HCV和GBV-B核心蛋白疏水结构域附近的两个紧密间隔的Pro残基似乎发挥了类似的作用，因为它们是HCV核心的LD靶向所必需的(霍普等人，2002年).

小泡蛋白是细胞表面小泡的组成成分(Smart等人，1999年). 小窝蛋白-1和-2在哺乳动物细胞类型中广泛分布，通常共存，而小窝蛋白-3是肌肉特异性的。Caveolin-2在高尔基体中积聚(Mora等人，1999年;Parolini等人，1999年)和在LD中(Fujimoto等人，2001年;Ostermeyer等人，2001年)除非caveolin-1与它异构化，共表达。

Caveolins有时会在LDs中积聚，在LDs可能起到信号传递和胆固醇平衡的作用(Fujimoto等人，2001年;Ostermeyer等人，2001年;Pol等人，2001年). 在以下四种条件下，在LD中发现Caveolins：（1）当NH中的序列₂-末端亲水结构域被删除，（2）当ER检索信号与小窝蛋白-1连接时，（3）当小窝蛋白-2在没有小窝蛋白-1的情况下表达时，以及（4）当用布雷费尔德蛋白A（BFA）处理细胞以阻断从ER到高尔基体的转运时。我们提出了以下模型来统一这些观察结果(Ostermeyer等人，2001年). 由于小窝蛋白与上述整合LD蛋白具有相同的拓扑结构，我们提出小窝蛋白对LD具有高亲和力。我们认为，在合成后，蛋白质通常被迅速包装成运输囊泡，阻止它们到达新生LD的表面。尽管囊泡包装机制可以饱和，但某些小窝蛋白突变体尚未被识别。这些条件导致小窝蛋白在内质网中积累，然后通过其他完整的LD蛋白使用的相同机制实现LD靶向。

Caveolin-2最初被认为比其他Caveolin对LDs有更高的亲和力(Fujimoto等人，2001年). 然而，当与内质网检索信号相连时，小窝蛋白-1也高度集中于LD(Ostermeyer等人，2001年). 在没有小窝蛋白-1的情况下，小窝蛋白-2通过分泌途径无效转运(Mora等人，1999年;Parolini等人，1999年). 因此，小窝蛋白-2的LD积累可能是由于内质网外的低效运输造成的。

在这里，我们首先提供了进一步的证据，证明小窝蛋白-1在内质网中的积累导致LD靶向。为了确定内质网细胞溶质面上缺少跨膜结构域的任何蛋白质是否可以在LD中聚集，我们检测了H-Ras，它最初是针对内质网的细胞溶质面的。最后，这项工作的主要目标是使用小窝蛋白-1作为模型来定义LD靶向信号。

Caveolin-1通常集中在COS细胞的小窝中，而不是LDs中(图1，A–C），但在BFA处理5小时后在LDs中累积(Ostermeyer等人，2001年;图1，D–F）。用亲脂性染料尼罗河红鉴定LDs(图1、B和E). 虽然在中不清楚图1，小窝蛋白-1在BFA处理后仍大量存在。在这里，我们利用BFA的能力诱导小窝蛋白-1的LD积累，以确定阻碍该靶向性的因素。

为了确定BFA诱导的LD积累是否需要完整的细胞骨架，用BFA处理微管被诺卡唑破坏或微丝被细胞松弛素B破坏的COS细胞5小时。两种药物均不抑制BFA诱导LD积累(图1，G–L；虽然没有描述，但在诺康唑治疗后，LD有时出现聚集）。然而，用环己酰亚胺阻断蛋白质合成大大减少了BFA诱导的LD积累，并且该蛋白质主要出现在点状小窝中(图1，M–O）。环己酰亚胺处理对LD密度或大小没有影响。这些发现与我们的建议一致，即新合成的caveolin-1通过在内质网膜中的扩散进入新生的LDs，并且在离开内质网后不能进入LDs(Ostermeyer等人，2001年).

进一步在COS或Fischer大鼠甲状腺（FRT）细胞中检测转染蛋白的实验，这些细胞缺乏内源性小窝蛋白-1和小窝蛋白，但可以将外源性表达的小窝蛋白1组装成小窝蛋白(Lipardi等人，1998年). 小窝蛋白-1在转染FRT细胞中的定位与COS细胞中的非常相似(Lipardi等人，1998年;Ostermeyer等人，2001年). 如前所述，在这两种细胞类型中，我们在高尔基体和小窝中都看到了小窝蛋白-1(Dupree等人，1993年;Denker等人，1996年;Luetterforst等人，1999年).

为了观察内质网细胞质表面是否有任何过度表达的蛋白非特异性地进入LDs，我们检测了H-Ras，H-Ras在合成后被招募到内质网，并通过分泌途径到达质膜(Choy等人，1999年). Ras蛋白在分泌途径中缓慢移动，在内质网和高尔基体中稳定存在。我们没有发现COS细胞中EGFP–H-Ras表达的LD染色（未发表数据）。由于质膜染色可能模糊了LD染色，我们表达了一个EGFP突变的非棕榈酰化H-Ras，它留在内质网和高尔基体中，不到达细胞表面(Choy等人，1999年). 为了鉴定LD，我们共表达了Cav-KKSL（caveolin-1和附加的ER检索基序），即使没有BFA，它也会在LD中积累(Ostermeyer等人，2001年). 非棕榈糖基化H-Ras具有弥漫性ER定位(图2，A和B)在Cav-KKSL阳性的LDs中，经或未经BFA处理的LDs很少检测到（<5%的转染细胞）。

为了证实跨膜蛋白被排除在LDs之外，我们用Cav-KKSL和胎盘AP（PLAP）–HA杂交蛋白共同转染FRT细胞(Arreaza和Brown，1995年)用BFA处理5h，然后进行间接免疫荧光显微镜（IF）处理。正如预期的那样，FRT细胞的LDs中从未检测到PLAP-HA(图2C） 或在COS单元中（未描述）。

在剩下的工作中，我们检测了caveolin-1突变体，试图确定LD靶向所需的序列。我们首先检测了BFA处理的FRT细胞中的突变体，寻找那些未能在LD中积累的突变体。突变体示意图和结果列于图3，所选突变体的图片如所示图4和5在BFA处理后，FRT细胞和COS细胞中，野生型小窝蛋白-1出现在具有LD特征性圆形的结构中(图4A、 箭头）标记LD标记蛋白ADRP(图5，A–C），66±15%(n个=6）BFA处理后转染细胞。尽管如前所述，有效检测ADRP畸变LD形状需要甲醇固定(DiDonato和Brasaemle，2003年)，ADRP和caveolin的共定位是明确的(图5，A–C）。小窝也可见Caveolin-1染色，但没有ADRP染色。在未经BFA处理的情况下，在FRT细胞的LDs中偶尔可以看到野生型caveolin-1（约占细胞的5%），在表达量最高的细胞中也可以看到这种野生型cavelolin-1。BFA处理后，小窝蛋白-1和所有检测到的突变体也出现在比小窝大的点状结构中，并分布在整个细胞中(图4A、 箭头）。这些结构没有ADRP染色，因此与LDs无关，但有GM130染色（未公布的数据），可能是内质网退出位点(Ward等人，2001年). 小窝蛋白-1在BFA处理的细胞中聚集在这些结构中的异常行为将在其他地方描述（未发表的数据）。

ΔN2，缺少NH下游一半₂-小窝蛋白-1的末端结构域（Δ46-95），在LD中累积(图3)或不带(Ostermeyer等人，2001年)BFA处理。ΔN2缺少小窝蛋白-1齐聚所需的结构域(Sargiacomo等人，1995年)并在速度梯度上作为单体进行迁移（未公布的数据）。因此，LD靶向caveolin-1不需要齐聚。NH末端附近的四重取代突变体₂-末端结构域97/SASA和ΔN1（Δ3-48）显示出BFA诱导的LD定位的有效性，ΔN1缺乏NH的上半部分₂-终端域(图3). 因为这些突变体横跨NH₂-末端结构域（S2、K96和R101除外），LD靶向不需要该结构域中的序列。选择BFA诱导的97/SASA的LD靶向作为代表性突变体，通过与ADRP共定位验证(图5，D–F）。BFA显著降低FRT细胞的总ADRP染色。然而，通过比较转染细胞和未转染细胞中的ADRP染色，野生型或突变型小窝蛋白-1的表达并没有诱导LD形成或改变LD密度(图5; 每个面板显示两个细胞，其中只有一个被转染）。97/SASA不能像野生型小窝蛋白-1那样有效地运输到细胞表面，这解释了为什么这种突变在ADRP阴性小窝蛋白中不如野生型蛋白突出(图5，将C与F进行比较）。

作为NH的最后20个残留物₂-终端域(Schlegel等人，1999年;Arbuzova等人，2000年)和COOH终端域(Luetterforst等人，1999年;Schlegel和Lisanti，2000年)小窝蛋白-1可以独立与膜结合，膜结合不需要疏水结构域。IF（未发表的数据）在高尔基体和质膜中检测到缺乏疏水结构域的小窝蛋白-1突变体（Δ101-134）。然而，在BFA处理后的LD中没有发现这种突变体。同样的caveolin-2突变体也有类似的行为(Fujimoto等人，2001年). 相反，它集中在点状GM130阳性结构中(图4B） ●●●●。为了确定特定疏水结构域残基在LD靶向中的重要性，我们检测了一系列突变体，其中五个或六个残基的序列基团通过疏水结构域被改变为丙氨酸。根据第一个取代的位置和取代的数量命名的突变体如图所示图3，从102A5开始。BFA处理后，所有这些突变体在LD中的累积效率与野生型caveolin-1一样，如118A5所示(图4C） 和123A6(图4D） ●●●●。我们的结论是，LD靶向不需要疏水结构域中的单个残基。

接下来的两个小窝蛋白-1突变体表明，疏水结构域的拓扑结构，而不是其长度，在LD靶向中可能很重要。我们首先从疏水结构域中删除了中心14个残基，生成Δ112-125。在BFA处理后，在LD中发现了这种突变(图4E） ●●●●。然而，缺失蛋白质最后59个残基的突变体Δ59终止于疏水结构域的中间（没有myc标签），在BFA处理后未在LDs中集中(图4F） ●●●●。尽管Δ112-125和Δ59的疏水结构域长度非常相似（Δ59中有18个残基，Δ112.125中有19个残基），但观察到了这些差异。

接下来，我们研究了延长小窝蛋白-1的疏水结构域对LD靶向的影响。虽然我们不知道疏水结构域的构象，但我们推测它可能会形成两个α螺旋，由一个紧密的弯分开。这种可能性指导我们制造插入突变体。为了最大限度地减少蛋白质结构的破坏，我们首先在疏水结构域中插入两组七亮氨酸（如果结构是螺旋形的，每组预计会形成两个螺旋圈），每端一个。插入位置的选择是为了在插入前使膜中的天然序列发生一个螺旋旋转。由此产生的蛋白质Ins-7L（1+2）浓缩在高尔基体中，可以在许多未经处理的细胞的质膜上检测到（未公布的数据），这表明它没有严重折叠错误。然而，BFA处理后LDs中未检测到Ins-7L（1+2）(图4G） 但却集中在ER（未描述）和GM130阳性点。小窝蛋白-1和ADRP的双重标记证实了LD对Ins-7L（1+2）的排斥作用，转染细胞和未转染细胞的ADRP染色比较表明，该突变并不影响LD的大小或密度(图5，G–I）。

接下来，我们制作了几个新的突变体，以确定为什么这种双插入突变体Ins-7L（1+2）被排除在LDs之外。Ins7L-1和Ins7L-2都只包含Ins-7L（1+2）中存在的两个7-Leu插入物中的一个。BFA治疗后，两种插入物在LD中积累(图4、H和I). 由于未知原因，即使未经BFA处理，Ins-7L-2仍在LDs和高尔基体中积累。

因此，从LD中排除双插入突变体Ins-7L（1+2）并不是由于两种插入都破坏了LD靶向信号。相反，仅仅将疏水跨度增加14个残基就有可能阻止LD靶向。为了验证这个想法，我们制作了两个新的双插入突变体。第二组7亮氨酸插入Ins-7L-1的疏水结构域中，靠近第一个插入位点，生成Ins-14L，因此包含14亮氨酸插入NH附近₂-疏水结构域的末端。BFA诱导的Ins-14L LD积累与野生型相似(图4J） 这表明，从LDs中排除Ins-7L（1+2）（原始双插入突变体）并不仅仅是因为其疏水结构域的长度增加。另一个突变体（Ins-7L（1+2）/Δ112-125）支持这一结论。为了制造突变体，我们从Ins-7L（1+2）的疏水结构域中删除了中心14个残基。因此，该突变体包含两个原始的7-Leu插入，但其疏水跨度与野生型小窝蛋白-1的长度相同。与Ins-7L（1+2）一样，在BFA处理后的LDs中几乎从未检测到这种突变(图4K） ●●●●。这一发现表明，Ins-7L（1+2）未能靶向LDs并不是由于其疏水跨度增加所致。

为了解释这些结果，我们推测Ins-7L（1+2）中插入残基上笨重的Leu侧链通过空间位阻效应阻止LD靶向，阻止疏水结构域中残基相互或与双层中其他蛋白质的适当堆积。根据这个模型，任何一种单独插入的效果都是可以容忍的，但两者结合起来都是禁止的。

为了确保LDs中某些突变体的明显排除不会导致低表达，我们比较了所选突变体的表达水平(图6). 突变体与PLAP-HA共表达，作为转染和负载控制。不同突变体的表达水平差异很大。尽管Ins-7L（1+2）的表达很低，但其他两个未能在LDs中积累的突变体Δ59和Ins-7L(图6，1-6车道）。因此，疏水结构域突变体的表达水平与LD积累无关。

Cys−，一种非棕榈酰化的三重Cys-Ser小窝蛋白-1突变体(Dietzen等人，1995年)在LDs和野生型蛋白质中积累(图3)表明LD靶向不需要棕榈酰化。一个缺乏整个COOH末端结构域ΔC的突变体定位于未经处理细胞的质膜和高尔基体（未发表的数据），与类似的小窝蛋白-2突变体不同，小窝蛋白2突变体集中于内质网(Fujimoto等人，2001年). 在BFA处理的细胞中，在少数细胞的LDs中检测到ΔC（转染细胞的30±7%，n个=5）与野生型caveolin-1相比，LD染色相对GM130阳性点状物染色更暗。内质网（包括核膜）的染色更为显著，表明与LDs的亲和力降低(图4五十） ●●●●。然而，ΔC的表达水平很低，接近或低于Ins-7L（1+2）(图6，第7和第8车道）。因此，LD靶向效率的明显部分降低可能是由于表达减少所致。

为了确保我们的结果不依赖于BFA治疗，我们将KKSL-ER检索标签附加到选定的小窝蛋白-1突变体。即使没有BFA，野生型Cav-KKSL也会在LD中累积(Ostermeyer等人，2001年). 类似地，几乎在每个表达细胞的LD中都检测到KKSL标记的97/SASA和Ins-7L1形式(图7). 这与BFA处理的细胞中相同蛋白的非KKSL标记版本的定位形成对比，其中60-80%的细胞检测到LD定位。KKSL标记蛋白的LD积累增加，可能是因为它们在BFA处理期间持续被回收到内质网，而不是仅在内质网中积累5小时。然而，在LD中从未发现KKSL标记形式的Ins-7L（1+2）和Ins-7L(图7)尽管Ins-7L（1+2）-KKSL以及野生型Cav-KKSL、97/SASA-KKSL和Ins-7L1-KKSI均表达。Ins-7L（1+2）+Δ112-125-KKSL表达水平较高（未公布数据）。因此，某些突变体不能在LD中积累并不依赖于BFA处理。

为了证实IF结果，我们检测了从转染FRT细胞中分离的LDs是否存在野生型Cav-KKSL或选择的KKSL标记突变体(图8). 全细胞匀浆等分样品(图8、WC）和隔离LD(图8检测转染FRT细胞的calnexin（用于监测LD部分的ER污染）、ADRP（用于监测LD产量）和各种小窝蛋白突变体（用于监测表达和LD靶向）。与IF结果一致，LD中存在野生型Cav-KKSL和97/SASA-KKSL，而Ins-7L（1+2）-KKSL以及Ins-7L(图8).

我们为我们的LD靶向caveolin-1模型提供了额外的支持(Ostermeyer等人，2001年). 在这个模型中，我们认为当小窝蛋白在内质网中积累时，它们通过在内质网膜中扩散到达新生LD的表面。与这一想法一致，BFA诱导的小窝蛋白-1的LD靶向不需要微管或微丝。该模型预测，小窝蛋白-1在BFA治疗时必须在ER中才能进入LD。正如预测的那样，在BFA处理期间，用环己酰亚胺处理细胞以阻止新的小窝蛋白-1合成和内质网插入，从而阻止了BFA诱导的LD积累。

虽然这个模型解释了小窝蛋白是如何到达LD表面的，但它并没有解释为什么它们在那里变得如此集中。非棕榈酰化H-Ras的ER定位和拓扑结构表明，它应该能够到达LD和小窝蛋白，但从未在那里积累。因此，我们的第二个目标是了解为什么小窝蛋白对LD具有如此高的亲和力。

尽管其中没有特定的序列，但疏水结构域是LD靶向小窝蛋白-1所必需的。相反，疏水结构域对小窝蛋白-1的膜结合不是必需的。因此，膜结合不足以实现LD靶向。一些证据表明，小窝蛋白-1的不寻常拓扑结构（两个细胞质结构域位于中央疏水结构域的两侧）是LD靶向完整蛋白质的关键决定因素。首先，真正完整的LD蛋白、油素和钙素具有相同的拓扑结构(黄，1992;Chen等人，1999年). 其次，缺乏整个疏水结构域或在结构域的前半部分结束的小窝蛋白-1突变体不是针对LD的。同样，在LD中也没有检测到缺乏疏水结构域的小窝蛋白-2突变体(Fujimoto等人，2001年). 然而，突变分析表明，疏水结构域中没有特定的残基对LD靶向至关重要。这一发现表明，Pro-not基序在脂质体的LD靶向中很重要(Abell等人，1997年)和HCV核心(霍普等人，2002年)对于整体蛋白质的LD靶向，并不普遍需要。

尽管小窝蛋白-1的疏水结构域中绝对不需要残基，但该结构域中的某些插入突变大大降低了LD靶向性。将两个7-Leu片段插入疏水结构域，每端一个，阻断LD靶向。即使疏水结构域的中心14个残基也被删除以恢复疏水结构域正常长度，LD靶向也被阻断。仅仅从野生型蛋白质中删除14个中心疏水残基来缩短结构域，并不能阻止LD靶向。仅含有一个7-Leu插入的突变体的LD靶向性不受影响。类似地，在NH附近插入两个7-Leu片段₂-疏水结构域的末端，并没有阻断LD靶向。因此，插入的Leu残基在疏水结构域中的位置，而不是它们的数量或疏水结构域的总长度，可能会影响LD靶向。

我们不知道小窝蛋白-1疏水结构域的结构，这限制了我们对结果的解释。然而，一个吸引人的模型是，该域形成两个α螺旋，并由一个紧弯分开。满足主链氢键的需要对脂质包埋蛋白质结构域的可能构象造成了严重限制。除了某些细菌蛋白质中的β桶结构外，所有已知的跨膜肽都是α螺旋的(Monne®等人，1999年). 然而，值得注意的是，有人建议油素的疏水结构域形成一条延伸的β链，与相邻分子中的链平行排列(Li等人，2002年)，尽管其他人认为该区域是螺旋状的(莱西等人，1998年). 然而，具有短至31个残基的疏水结构域的模型蛋白被证明能够形成螺旋-转-螺旋基序，而在转时对Pro没有绝对要求(Monne®等人，1999年). 因此，我们接下来将考虑一个模型，如果疏水结构域形成螺旋-转螺旋基序，Leu插入如何影响小窝蛋白-1的LD靶向。

如图所示图9（A和B），我们认为两个假定的疏水螺旋的适当包装对于小窝蛋白-1的LD靶向非常重要。七个亮氨酸将形成两圈α螺旋。我们推测，笨重的亮氨酸侧链会干扰螺旋的正确堆积，或者干扰其他膜蛋白。单独插入一个7-Leu或在疏水结构域的一端插入14-Leu可能是可以耐受的。然而，在两个螺旋中同时插入7个Leu可能会破坏螺旋堆积，足以阻断LD靶向，特别是当螺旋通常相互堆积时。与此可能性一致，如所示图9C、 疏水结构域的前半部分形成的螺旋的一个面将完全由Gly和Ala组成，它们的小侧链在与膜中其他螺旋紧密结合的疏水螺旋面上非常受欢迎(Eilers等人，2002年).

小窝蛋白-1的COOH末端结构域可能增强LD靶向性，尽管ΔC的表达减少限制了这一结论的确定性。然而，值得注意的是，融合到EGFP的小窝蛋白-2的疏水结构域并没有局限于LD(Fujimoto等人，2001年). 这与小窝蛋白-1中除疏水结构域外，还需要其他序列来靶向LD的想法一致。这样的序列（可能包括COOH末端结构域）可以通过稳定疏水结构域的正确包装来促进LD靶向。

前结基序在脂质体（可能还有钙调素）和丙型肝炎病毒核心LD靶向中的确切作用(霍普等人，2002年)未知。在油素中，该基序位于70-残基疏水结构域的中心，有人认为该基序可以诱导180°转角的形成(Tzen等人，1992年). 可以想象，得到的两个35个残基的疏水螺旋（或者，可能是β-片结构；黄，1992)太长，不适合ER双层。因此，一个模型是，Pro结迫使形成对于双层来说太长但可以容纳在LD中的螺旋。

该模型在解释Pro-not在LD靶向其他蛋白质中的作用方面不太有吸引力。首先，它们的疏水结构域比油素的短得多，很容易容纳在双层中，双层可以容纳螺旋发夹(Monne®等人，1999年). 此外，尽管HCV和GBV-B核心蛋白的中心结构域比相邻结构域更疏水，但它们包含多个带电荷的残基，并可能形成两亲性螺旋，如HCV核心前结下游的24个残基所示(图9D） ●●●●。这个假定螺旋的一面几乎完全含有带电残基(图9D、 正方形），并且不太可能完全嵌入双层或LD中。相反，由这些残基形成的螺旋可能与表面平行，就像其他两亲螺旋一样(Johnson和Cornell，1999年). 类似地，钙调素中的前结位于疏水结构域的末端，邻近一个可能形成两亲性螺旋的高电荷序列(Naeste等人，2000年). 因此，Pro基序通常不会通过强迫形成过长的疏水螺旋而在LD靶向中起作用。

我们认为，适当的疏水螺旋包装可能对小窝蛋白的LD靶向很重要。其他LD蛋白也可能如此。在可溶性蛋白质中，脂质包埋螺旋通常比螺旋紧密(Eilers等人，2000年)我们推测紧密堆积可能对LD蛋白特别重要。HCV核心中Pro结下游的24个残基形成的螺旋将具有富含Gly+Ala的表面(图9D、 圆圈）。此外，NH₂-油素疏水结构域的末端一半异常富含甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸(Tzen等人，1992年)在膜包埋螺旋体之间的接触部位受到青睐(Eilers等人，2002年). Pro-not可能通过影响疏水螺旋堆积作用于LD靶向。Caveolins可以通过不同的机制实现相同的目的（正确的包装）。甚至有可能出现ADRP和紫苏素LD靶向性研究的令人困惑的结果(Garcia等人，2003年;Targett-Adams等人，2003年)反映了明显多余的LD靶向基序的要求，以正确组合在一起以实现最佳LD靶位。

尽管LD存在于大多数真核细胞中，但令人惊讶的是，人们对LD的合成或代谢，以及蛋白质是如何靶向其表面的，知之甚少。我们的研究结果表明，正确的疏水结构域包装对于小窝蛋白的LD靶向以及其他蛋白质的LD可能至关重要。还需要进一步的研究来了解这种靶向作用以及LD蛋白的功能。

FRT和COS-1细胞已在前面描述过(Ostermeyer等人，2001年). 使用的主要抗体如下：兔抗小窝蛋白-1和鼠抗GM130（转导实验室）；小鼠抗亲脂蛋白/ADRP（研究诊断）；兔抗PLAP（DakoCytomation）；小鼠抗myc（Invitrogen）；兔抗凝血酶(Manganas等人，2001年; 加利福尼亚大学戴维斯分校J.Trimmer的礼物）。使用的二级抗体如下：二氯三嗪氨基荧光素（DTAF）-山羊抗鼠Ig（G+M）（GAM）、FITC-山羊抗兔IgG（GAR）、德克萨斯红GAR和GAM、HRP-GAM和HRP-驴抗兔Ig G（杰克逊免疫研究实验室）和Alexa Fluor 350-GAR（分子探针）。Lipofectamine 2000来自GIBCO BRL，其他试剂来自Sigma-Aldrich。

编码GFP–H-Ras和非棕榈酰化GFP–H RasC181S、C184S的质粒(Choy等人，1999年)是M.Philips（纽约大学，纽约州纽约市）的礼物。一种编码杂合蛋白PLAP-HA的质粒，包含PLAP的胞外结构域和流感血凝素的跨膜和细胞质结构域，已在前面描述过(Arreaza和Brown，1995年). 编码NH的质粒₂-前面已经描述了末端HA标记和COOH末端myc标记的犬小窝蛋白-1（α亚型），这是一种该蛋白（Cys−）的非棕榈酸化突变体，以及小窝蛋白-ΔN2（这里称为ΔN2）(Dietzen等人，1995年;Ostermeyer等人，2001年). 使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）或PCR产生额外的犬小窝蛋白-1突变体，并通过测序进行验证。非自解释突变体如下，使用犬小窝蛋白-1α：Ins-7L（1+2）中的残基数，在A105后插入7个Leu，在V130后插入七个Leu；Ins-7L1，在A105后插入7个Leu；Ins-7L2，V130后插入7个Leu；Ins-14L，在A105后插入7个Leu，在I109后插入七个Leu。名称102A5、107A5、113A5、118A5、123A6和130A5是指用丙氨酸取代指定数量的残基（5-6），从指定的残基开始。97/SASA；Y97、W98、F99、Y100分别更改为SASA。ΔN1，缺少G3-E48；ΔN2，缺少T46-T95；ΔC，缺少S136-T178；Δ59，缺少A120-T178。所有突变体都含有NH₂-端子HA标签。除Δ59外，所有都包含COOH-终端myc标签。

使用Lipofectamine 2000瞬时转染细胞，转染后1或2天观察。如果使用外荧光显微镜（Axioskop 2型；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.），如前所述(Ostermeyer等人，2001年)除PFA固定和渗透在25–27°C下进行外，甲醇固定（10 min，0°C）用于检测LD标记蛋白ADRP(Brasaemle等人，1997b). 尽管LD形状失真(DiDonato和Brasaemle，2003年)，可以检测到ADRP和caveolin在LDs上的共定位。所有图像均采用100倍物镜（NA=1.3）。图像由SPOT冷却CCD 24位彩色数码相机（Diagnostic Instruments，Inc.）拍摄，并使用Adobe Photoshop进行处理。如有指示，细胞在固定前用含有10μg/ml BFA、50μg/ml环己酰亚胺、10μg/ml细胞松弛素B和/或10μM诺卡唑的培养基培养5小时。

在IF实验中，用抗小窝蛋白-1抗体和DTAF-GAR检测到野生型和突变型小窝蛋白1，除非下文另有说明。当与PLAP-HA共表达时，检测到小窝蛋白-1与抗myc抗体。与尼罗河红共定位时，用蓝色Alexa Fluor 350 GAR二级抗体检测到小窝蛋白-1，尽管分辨率低于DTAF-GAR，因为尼罗河红色的荧光吸收曲线与DTAF（绿色）和德克萨斯红重叠。

如前所述，从油酸处理的FRT细胞中分离LD并通过丙酮沉淀回收LD蛋白(Garcia等人，2003年)进行了以下小修改。转染后5小时，将油酸-脱脂的BSA复合物添加到一个10厘米的融合培养皿中的细胞中。第二天，从培养皿中刮取细胞，在PBS中洗涤，在均质缓冲液中洗涤（10 mM Hepes，pH 7.4，和5 mM EDTA），用蛋白酶抑制剂（1μg/ml胃蛋白酶抑制素，0.2 mM PMSF和1μg/ml亮氨酸蛋白酶）在200μl均质缓冲溶液中再次悬浮，并通过25号针头将其均质35次。保留一份匀浆。用含有蛋白酶抑制剂的均质缓冲液将剩余物调节至1ml，并在100000下进行离心克在超离心机（Optima TL型；Beckman Coulter型）中放置30分钟。收集含有LDs的前200μl，并通过丙酮沉淀收集LD蛋白。如前所述，进行SDS-PAGE、转移到尼龙膜和蛋白质印迹(Schroeder等人，1998年).

我们感谢M.Philips提供的质粒，J.Trimmer提供的抗凝血酶抗体，以及N.Dean和Brown实验室成员阅读手稿。

这项工作得到了国家卫生研究院拨款GM47897（给D.A.Brown）和GM41297（给D.M.Lublin）的支持。