紧密连接股内部和之间异质Claudin物种的相互作用方式

兔抗鼠claudin-2 pAb和兔抗鼠claudin-3 pAb已在之前提出并鉴定(Kubota等人，1999年;Morita等人，1999a). 针对合成多肽CPRKTTSYPTPRPYPKPTPSSGKD（对应于小鼠claudin-1（氨基酸186-209）的COOH末端细胞质域），培养豚鼠抗小鼠claudin-1 pAb。这些pAbs在硝化纤维素膜上用GST融合蛋白与相应克劳丁的COOH末端细胞质域亲和纯化。GST融合蛋白表达于大肠杆菌（菌株DH5α），并用谷胱甘肽-Sepharose 4B珠纯化（Amersham Pharmacia Biotech）。

如前所述，产生大鼠抗鼠claudin-1单克隆抗体和大鼠抗小鼠claudin-2单克隆抗体(Itoh等人，1991年). 将GST融合蛋白与相应克劳丁的COOH末端细胞质域免疫Wistar大鼠，将淋巴细胞与P3骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞。通过表达claudin-1或-2的L转染体的免疫荧光染色或GST融合蛋白的免疫印迹筛选融合板。鼠标抗FLAG单克隆抗体（M2）购自伊士曼柯达公司。

构建表达GST/claudin-1和GST/claudin-2融合蛋白的质粒E类。大肠杆菌，通过PCR扩增编码claudin-1（氨基酸188–211）和claudin-2（氨基酸189–230）的COOH末端细胞质区的cDNA。将每个cDNA片段亚克隆到pGEX4T-1（Amersham Pharmacia Biotech）中，生成pGEX-IN（GST/claudin-1）和pGEX-IU（GST/claudin-2）。GST/claudin-3表达质粒的构建如前所述(Morita等人，1999a).

克劳丁-1、-2和-3的哺乳动物表达载体构建如下。从pGTCL-1或pGTCL-2中切下包含claudin-1或-2的整个开放阅读框的cDNA片段(Furuse等人，1998年b)分别通过SacI或EcoRI消化。将每个DNA片段亚克隆到pCAGGSneodelEcoRI中(Niwa等人，1991年)产生表达载体pCCL-1（克劳丁-1）和pCCL-2（克劳丁-2）。同样，将claudin-3 cDNA的整个开放阅读框亚克隆到pCAGGSneodelEcoRI中，构建表达载体pCCL-3(Morita等人，1999a). 为了构建缺失COOH末端胞质结构域的claudin-1突变体的表达载体，利用引物GGCGACATAGTGGCCACAGCATG（sense）和CGCGGATCTCCGGGGACAGGAGCCA（antisense），通过PCR获得与148-188氨基酸对应的claudin-1 cDNA片段，然后进行EcoRI和BamHI消化。从含有FLAG-tagged claudin-1 cDNA的质粒pSKCL-1F中删除了编码氨基酸148-211的claudin-1cDNA片段(Furuse等人，1998年a)经EcoRI和BamHI消化，并被此PCR-扩增的截短cDNA片段取代。然后将FLAG标记的COOH末端胞质结构域缺失的claudin-1 cDNA亚克隆到表达载体pCAGGSneodelEcoRI中，使pCCL-1ΔCF。

为了建立单独表达claudin-1、-2或-3（分别为C1L、C2L和C3L）的L转染体，将1μg pCCL-1、pCCL-2或pCCL-3转染在35-mm培养皿中的小鼠L细胞，并使用脂质体+（GIBCO BRL）将其转染到1ml Opti-MEM中。在含有500μg/ml G418的DME中选择14–16天后，获得抗性菌落。通过免疫荧光显微镜对分离的克隆进行筛选。用1μg pCCL-2和0.1μg pPGKpuro的混合物转染C1L细胞，建立共表达claudin-1和-2的C1C2L细胞，然后在含有8μg/ml嘌呤霉素的DME中筛选。同样，通过分别用pCCL-1和pCCL-2以及pGKpuro转染C3L细胞产生C1C3L和C2C3L细胞。通过转染表达FLAG-claudin-1的C1FL细胞，建立了在COOH末端与FLAG标签共存的C1FC2L细胞和claudin-2细胞(Furuse等人，1998年b)含1μg pCCL-2和0.1μg pSV2hph(Santerre等人，1984年)然后在200μg/ml的潮霉素B中进行筛选。通过将pCCL-1ΔCF转染L细胞，产生表达COOH末端胞质结构域调控的克劳丁-1和FLAG-tag的C1ΔCFL细胞，然后进行G418筛选。每次转染实验都分离出几个稳定的克隆。其中，C1L克隆16、C2L克隆12、C3L克隆17、C1C2L克隆1、C1C3L克隆12，C2C3L克隆15、C1FC2L克隆11和C1ΔCFL克隆16被重新命名并用于本研究，因为它们表达了相对大量的导入蛋白。小鼠L细胞和转染体在添加10%FCS的DME中培养。

SDS-PAGE按照莱姆利1970和蛋白质从凝胶电泳转移到聚二氟乙烯膜上。将膜浸泡在5%脱脂牛奶中，并与初级抗体孵育。清洗后，用大鼠、兔子（Amersham Pharmacia Biotech）或豚鼠（Chemicon International，Inc.）IgG的第二抗体培养细胞膜，然后用链霉亲和素结合碱性磷酸酶（Amersham Pharmacia-Botech）培养细胞膜。使用硝基蓝四氮唑和溴氯吲哚磷酸作为底物来观察酶反应。

L转染体（1.5×10⁶细胞）用盖玻片固定在60mm培养皿上。共培养7.5×10⁵将每种转染剂的细胞混合后进行细胞培养。培养48小时后，将盖玻片上的细胞在室温下用1%甲醛在PBS中固定10分钟，用PBS洗涤，并用0.2%Triton X-100在PBS内处理10分钟。然后用PBS清洗细胞，用1%BSA在PBS浸泡，并在潮湿的室内与一级抗体孵育30分钟。用PBS洗涤三次后，将细胞与荧光标记的第二抗体孵育30分钟。FITC-结合山羊抗鼠IgG（BioSource International）、Cy3-结合山羊抗兔IgG，罗丹明结合山羊抗豚鼠IgG和FITC-结合山羊抗兔IgG（Chemicon International，Inc.）用作二级抗体。细胞用PBS清洗三次，然后安装在含有对苯二胺和1%的90%甘油-PBS中n个-丙基半乳糖。如前所述，小鼠肝脏冰冻切片免疫荧光染色(Furuse等人，1993年). 使用蔡司Axiophot荧光显微镜观察标本，并使用SensysTM冷却CCD摄像系统（Photometrics）记录图像。

对于传统的冷冻断裂EM，培养在60-mm培养皿上的L转染体用2%戊二醛固定在0.1M二羧酸钠缓冲液（pH 7.3）中，在4°C下过夜，用0.1M二羰酸钠缓冲溶液洗涤三次，在0.1%二羧酸盐缓冲液中30%甘油浸泡2h，然后在液氮中冷冻。在Balzers冷冻蚀刻系统（BAF060，BAL-TEC）中，冷冻样品在−100°C下断裂，铂以45°角单向遮蔽。然后将样品浸入家用漂白剂中，将漂浮在样品上的复制品放在塑料薄膜格栅上，并用JEOL 1200 EX电子显微镜在100 kV的加速电压下进行检查。

用于检查冻裂复制品的免疫电子显微镜如所述进行藤本1995将小鼠肝脏切成小块，并用HPM010高压冷冻机（BAL-TEC）在高压液氮中快速冷冻。L转染子在室温下用0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.3）中的1%多聚甲醛固定5分钟，在0.1M磷酸盐缓冲液中洗涤三次，在0.1M磷酸盐缓冲液中的30%甘油中浸泡3小时，然后在液氮中冷冻。然后，按照所述对冷冻样品进行断裂和阴影处理。样品在含有2.5%SDS、10mM Tris-HCl和0.6M蔗糖（pH 8.2）的裂解缓冲液中浸泡并在室温下搅拌12小时，然后用含有5%BSA的PBS清洗样品上漂浮的复制品。复制品与一级抗体孵育2小时，用PBS-BSA清洗，用胶体金结合二级抗体孵育，用PBS-BSA洗涤，然后在formvar膜网格上拾取。山羊抗兔IgG与5-nm金偶联，山羊抗鼠IgG和15-nm金偶联（Amersham Pharmacia Biotech），山羊抗豚鼠IgG结合15-nm金（英国生物细胞国际）用作二级抗体。

我们提出了针对克劳丁-1、-2和-3的COOH末端细胞质结构域的单克隆和多克隆抗体。GST融合蛋白与克劳丁-1、-2和-3的COOH末端尾部的免疫印迹证实了这些抗体的特异性(图2A） ●●●●。然后，将编码claudin-1、-2和-3的cDNA转染到L成纤维细胞中，获得稳定的转染体（分别为C1L、C2L和C3L细胞）。当这些转染体的总细胞裂解物用抗氧化酶-1、-2和-3 pAbs进行免疫印迹时，可以清楚地检测到具有预期分子量的相应克劳丁条带(图2B） ●●●●。

之前，我们获得了稳定表达claudin-1或-2的L转染体，在其COOH末端（分别为C1FL和C2FL细胞）标记有FLAG序列，并发现引入的FLAG-claudin-2以精细的网络模式集中在细胞-细胞接触面(Furuse等人，1998年b). 用免疫荧光显微镜对C1L、C2L和C3L细胞进行抗氧化酶-1、-2或-3抗体的检测，发现引入的无表位标记的克劳丁-1、-2和-3也高度集中在细胞-细胞边界，形成精细的网络(图2C） ●●●●。与C1FL和C2FL细胞相似，在C1L、C2L和C3L细胞的细胞-细胞接触面上诱导了发育良好的rTJ链/槽网络，如传统冷冻断裂EM所示（参见图5、g–i和图8、a和b）。从形态特征以及免疫荧光显微镜在细胞接触面检测到的网络大小判断(图2C、 C，f，i，l和o），这些网络中的每条线可以被视为代表单独的rTJ链。这些免疫荧光观察进一步证实了本研究中使用的抗核蛋白-1、-2和-3单克隆抗体和单克隆抗体的特异性。

Northern印迹显示，几个不同种类的克劳丁在单个器官中共存，例如肺、肝和肾(Furuse等人，1998年a;Morita等人，1999a). 由于claudin-1、-2和-3似乎在肝脏中表达，我们首先用豚鼠antocaudin-1 pAb/兔antocaudian-2 pAb或豚鼠antocAudin-1 p Ab/兔子antocauding-3 pAb对小鼠肝脏冰冻切片进行双重染色。如所示图3a–d、claudin-1、-2和-3在沿胆管的连接复合体区域共定位。这些发现表明，克劳丁-1、-2和-3在这些细胞中均匀混合，至少在免疫荧光显微镜下是这样。此外，从小鼠肝脏获得的冷冻骨折复制品用反式胆红素-1 pAb和反式胆囊收缩素-3 pAb双重标记(图3e） 。尽管由于未知原因，豚鼠抗凝血素-1 pAb对冷冻断裂复制品的标记能力很低，但分别代表claudin-1和-3定位的15-nm和5-nm金颗粒似乎沿着单个TJ链混合。因此，在TJ链的水平上，claudin-1、-2和-3很可能作为claudin的杂聚合物共聚到单个TJ链中（参见图1B、 型号C和D）。

为了评估这种可能性，我们使用L转染剂作为模型系统。如前所示(Furuse等人，1998年b)和中图2C、 claudin-1、-2和-3可以在L转染体中形成均聚物。然后我们共同转染克劳丁-1和-2、克劳丁-1或克劳丁-3或克劳丁-2和-3，并获得稳定的转染体（分别为C1C2L、C1C3L或C2C3L细胞；图4A） ●●●●。当C1C2L细胞融合培养物用反转录酶-1单克隆抗体和反转录酶-2单克隆抗体双重染色时，两种克劳丁在细胞-细胞接触面上表现出相同的浓度模式(图4B、 a和B）。此外，在更高的放大倍数下，通过抗凝血素-1mAb和抗凝血素-2pAb在细胞-细胞接触平面上观察到几乎相同的染色网络模式(图4B、 g–i）。同样，claudin-1和-3以及claudin-2和-3也分别在C1C3L和C2C3L细胞中共定位(图4B、 c–f）。

接下来，我们用常规冷冻断裂电镜观察了C1C2L、C1C3L和C2C3L细胞中rTJ链的形态。如前所示，C1FL和C2FL细胞(Furuse等人，1998年b)在戊二醛固定的C1L细胞中，claudin-1诱导的链主要与原生质（P）面相关，作为细胞外（E）面（P面相关TJ；参见图5g） 而在C2L细胞中，claudin-2诱导的链在P面是不连续的，在E面有互补的凹槽，这些凹槽被颗粒链占据（E面相关的TJ；参见图5h和8a；Tsukita and Furuse 1999年). 与C1L细胞相似，在C3L细胞中诱导了P-face相关的TJ（参见图5i和8 b）。有趣的是，C1C3L细胞具有典型的P面相关TJ(图5b） 而C1C2L和C2C3L细胞在P面和E面相关TJ之间表现出rTJ链/槽的中间形态(图5、a和c）；C1C3L细胞E面上的凹槽完全是空的(图5e） 而C1C2L和C2C3L细胞中的颗粒分布均匀(图5d和图f). 这些发现表明，在这些L转染子中，两种不同的claudins在单个rTJ链中完全混合。

为了证实这一推测，从融合的C1C2L细胞中获得的冷冻断裂复制品用豚鼠抗核蛋白-1 pAb和兔抗核蛋白-2 pAb进行双重免疫标记。如所示图6a、 分别代表claudin-1和claudin-2定位的15纳米和5纳米金颗粒似乎沿着单个rTJ链混合。在C1C3L细胞中也获得了类似的结果(图6b） ●●●●。然而，如上所述，抗坏血酸-1 pAb对冷冻断裂复制品的标记能力相当低（参见图3e） 。因此，我们获得了共表达claudin-2和FLAG-tagged claudin-1的L转染体（C1FC2L细胞），从融合的C1FC2L细胞中获得的冷冻断裂复制品用抗FLAG mAb（15-nm金颗粒）和反式audin-2 pAb（5-nm金颗粒；图6c和图d). 在这些图像中，大量的15纳米和5纳米金颗粒似乎均匀地分布在单个rTJ链上。与一起使用图5，我们得出结论，在L转染剂的模型系统中，不同种类的克劳丁可以共聚形成rTJ链作为异质聚合物（参见图1B、 型号C或D）。

如中所述图1A、 在TJ中，每条TJ链与对置膜中的另一条TJ链横向结合，负责TJ的细胞间粘附。下一个问题是，这种横向联系，即TJ处的细胞粘附，是否归因于克劳丁细胞外区域的亲同或亲异相互作用。由于在C1L、C2L和C3L细胞中诱导成对rTJ链，克劳丁的亲同性相互作用如模型A所述(图1B） 可以在这些单元格中预期。接下来，我们研究了克劳丁在均聚物之间异嗜性相互作用的可能性(图1B、 模型B）通过共培养C1L、C2L和C3L细胞对。

如所示图7a–c，当C1L和C3L细胞共同培养，并用反转录素-1单克隆抗体和反转录素-3单克隆抗体双重染色时，根据免疫荧光染色区分三种类型的细胞-细胞接触面：claudin-1阳性/claudin-3阴性面，这将在相邻的C1L细胞之间形成；claudin-1–阴性/claudin-3–阳性平面，在相邻C3L细胞之间形成；以及在相邻的C1L和C3L细胞之间形成的claudin-1阳性/claudin-3阳性平面。在更高的放大倍数下，在claudin-1阳性/claudin-3阳性平面中，C1L和C3L细胞中的claudin-1和claudin-3分别以精细的网络模式集中(图7j和图k)，其网络大多重叠(图7l） ●●●●。C2L和C3L细胞的共培养也获得了相同的结果(图7、d–f和m–o）。这些发现表明，基于克劳丁-3的均聚物（rTJ链）可以分别通过克劳丁-3与克劳丁-1和克劳丁-2的异嗜相互作用与基于克劳丁-1的均聚体横向结合。相反，当C1L和C2L细胞共同培养，并用反转录素-1单克隆抗体和反转录素-2单克隆抗体双重染色时，未形成claudin-1阳性/claudin-2阳性平面(图7，g–i）。因此，很可能，至少在L转染体中，克劳丁-1不能以异嗜性方式与克劳丁-2相互作用。总之，在L转染体中，除了克劳丁的某些组合外，成对的链不仅可以通过亲同相互作用形成，还可以通过克劳丁的异亲相互作用形成。

为了进一步证实这一结论，C2L和C3L细胞的融合共培养物用戊二醛固定，并用常规冷冻断裂电镜检查(图8). 如上所述，C2L和C3L细胞中诱导的TJ分别与E面和P面相关，即C2L/C2L接触面的断裂面在P面上显示出不连续的股线（P-C2L图8a） 和E面上被颗粒链占据的凹槽（E-C2L in图8a） 而C3L/C3L接触面处的断裂面在P面上显示出连续的股线（P-C3L图8b） 和E面上的空槽（E-C3L英寸图8b） ●●●●。在C2L/C3L共培养中，除了这些C2L/C2L和C3L/C3L断裂面之外，偶尔会鉴定出源自相邻C2L和C3L细胞之间的接触区域的断裂面。在这些平面中，如预期，E-C2L和P-C3L(图8c） 或E-C3L和P-C2L（数据未显示）配对。有趣的是，如图8c、 当断裂面从E-跳跃到P-面时，E-C2L凹槽和P-C3L链的网络模式的连续性得到了完全保持，这最终表明在这些平面中，C2L细胞中的单个claudin-2均聚物总是与claudin-3均聚物横向结合，在相邻的C3L细胞中形成TJ。

在本研究中，我们从克劳丁-克劳丁相互作用的角度讨论了TJ链的形成。然而，我们应该考虑外周膜蛋白可能参与TJ链的形成。由于claudins的COOH末端细胞质域被认为负责与外周膜蛋白的相互作用，我们构建了一个缺乏其COOH端细胞质域的claudin-1突变体（claudin-1-ΔC），获得了表达FLAG-tagged claudin-1-ΔC（C1ΔCFL细胞；图9A） ●●●●。这些克劳丁突变体集中在细胞-细胞边界，如免疫荧光所示图9B.从C1ΔCFL细胞获得的冷冻断裂复制品表明，该claudin-1突变体仍然具有发达的rTJ链网络(图9C） 有趣的是，这些rTJ股主要与P面相关，主要是连续结构，E面有空槽。这些发现表明，克劳丁和外周膜蛋白之间的相互作用对于TJ链的形成及其P面结合本身并不是必需的。

先前的研究表明，克劳丁在质膜内聚合，构成TJ链的主干(Furuse等人，1998年a,Furuse等人，1998年b). 此外，可以接受的是，每个TJ链在对置膜中与另一个TJ链横向结合，形成成对链。因此，克劳丁之间有两种相互作用的方法；聚合形成TJ链的并排相互作用，以及每对链之间的头对头相互作用，以实现细胞粘附。因为克劳丁是一个多基因家族(Furuse等人1998a;Morita等人1999a;Tsukita and Furuse 1999年)，上述每种相互作用方法都可以进一步细分为亲同性和亲异性相互作用(图1B） ●●●●。因此，成对TJ链的可能分子组织可分为四种模型(图1B、 型号A至D）。在本研究中，我们使用单独或联合表达claudin-1、-2和-3的L转染剂评估了这些模型。首先，单种克劳丁足以重组TJ链，表明这些细胞中形成了均聚物（参见图2;Furuse等人，1998年b). 此外，这些均聚物都是横向结合的，均为亲同型（参见图2)以及异性恋方式（参见图7). 因此，L转染体中的TJ可以采用A型和B型中的两种组织(图1B） ●●●●。另一方面，L转染剂中也诱导了异质聚合物（参见图4). C型和D型(图1B） 在L转染系统中没有区别，但由于A型和B型都可能，C型和D型也可能(图1B） ●●●●。

在冷冻断裂复制图像中，TJ链的厚度为～10-nm(施泰赫林1973,施泰赫林1974). 有趣的是，由六个连接蛋白组成的间隙连接通道的直径也为~10 nm(Kumar和Gilula，1996年;江和Goodenough 1996). 由于连接蛋白也有四个跨膜结构域，与克劳丁具有相同的膜拓扑结构，因此很容易推测克劳丁的低聚物也是TJ中的单元结构，并且这些单元结构是线性排列的，形成单独的TJ链。这就提出了一个新的问题，即这些单位结构本身是同质还是异体，进一步细分了上述四种模型；杂聚合物可以由线性排列的异聚单元结构以及不同的同聚单元结构形成。这种类型的讨论已经详细报道了缝隙连接，其中单元结构已经确定(Kumar和Gilula，1996年;江和Goodenough 1996)但在TJ股中，单元结构的澄清是进一步讨论的先决条件。

Northern印迹显示，大多数组织表达两种以上的克劳丁(Furuse等人，1998年a;Morita等人，1999a). 免疫荧光显微镜显示TJs原位在肾脏中含有克劳丁-4和-8(Morita等人，1999a)肝脏中的克劳丁-1、-2和-3(图3). 因此，取共转染实验的结果（参见图5和图6)，虽然少突胶质细胞髓鞘和睾丸支持细胞中的特化TJ链似乎主要由一种克劳丁，即克劳丁-11组成，但原位大多数TJ链很可能是克劳丁的异质聚合物(Morita等人，1999b). 如本研究所示，在每对TJ链之间不仅允许克劳丁的亲同性相互作用，也允许克劳丁与异亲性相互作用。因此，在异聚物的配对TJ链中，预计会发生各种claudin物种的原位同源相互作用，以及claudin物种的各种组合之间的异亲相互作用，如模型D所示(图1B） ●●●●。可以合理地假设，这些相互作用的强度根据所涉及的claudin种类及其组合而变化，并且每个TJ链的紧密性总体上由claudin种类的数量/类型及其在链中的混合比决定。例如，MDCK I细胞具有比MDCK II细胞更紧密的TJ屏障，但在这两个不同的MDCK细胞克隆之间，TJ链的数量没有发现差异(史蒂文森等人，1988年). 这些观察结果表明，这两个克隆之间的配对TJ链在紧密性方面存在着质的差异，这种差异可以按照上述假设进行解释。

为了避免进一步的复杂性，我们没有讨论闭塞素。免疫复制分析表明，在大多数类型的上皮细胞中，闭塞素也原位并入TJ链(藤本1995;Furuse等人，1996年;Saitou等人，1997年). 当闭塞素与克劳丁-1共同转染到L细胞中时，它们被合并成rTJ链（当然也成对地转染rTJ；Furuse等人，1998年b). 单独导入L细胞的闭塞素以点状方式集中在细胞-细胞边界，表明闭塞素在相邻细胞之间以亲同方式相互作用(Furuse等人，1998年b). 此外，当表达闭塞素的L转染体与C1L细胞共培养时，闭塞素或克劳丁-1均未在细胞-细胞边界富集，这表明闭塞素不会在相邻细胞之间以异嗜性方式与克劳丁-1相互作用（Furuse，M.和S.Tsukita，未发表的数据）。因此，目前很难推测闭塞素是如何原位并入克劳丁（TJ链）的成对杂聚合物中的。闭塞素可以以与克劳丁相同的方式并入基于克劳丁的TJ链中，在成对的TJ序列中，闭塞素可以与闭塞素相对放置，从而允许闭塞素-闭塞素相互作用(Furuse等人，1998年b). 或者，它可以与claudin相对放置，claudin可能导致小孔的形成。也可能是闭塞素参与TJ链形成的方式与克劳丁不同。

最后，我们应该讨论外周膜蛋白的可能作用，例如ZO-1(史蒂文森等人，1986年)、ZO-2(Gumbiner等人，1991年)和ZO-3(Balda等人，1993年;Haskins等人，1998年)形成TJ股。ZO-1（而非ZO-2或ZO-3）在L细胞中内源性表达，这种内源性ZO-1在C1L和C2L细胞中分别与claudin-1和-2在细胞-细胞边界共同富集，形成精细的网络（Itoh，M.，M.Furuse，K.Morita和S.Tsukita，未发表的数据）。在我们之前的研究中(Furuse等人，1998年b)，我们报道在L转染体中，COOH末端带有FLAG标记的claudin-1和-2也形成了rTJ链的发达网络。然而，有趣的是，内源性ZO-1没有被招募到这些基于FLAG-claudin-1或FLAG-claudin-2的rTJ链中，可能是因为FLAG序列影响了claudin/ZO-1相互作用（Furuse，M.和S.Tsukita，未发表的数据）。这些发现表明，L转染体中rTJ链的形成不需要ZO-1（以及ZO-2和ZO-3）。此外，图9结果表明，一个缺乏几乎所有COOH末端细胞质结构域的claudin-1缺失突变体在L转染体中仍然形成了一个发育良好的rTJ链网络，这支持了外周膜蛋白不参与质膜内claudins聚合的观点。因此，我们在没有考虑外周膜蛋白可能参与的情况下解释了本研究中的数据。

本研究中使用的L转染剂模型系统对于分析每个克劳丁物种的特性非常有用。迄今为止，克劳丁家族已有15名成员被确认身份，但未来将有多少克劳丁被确认身份尚不清楚。因此，通过使用上皮细胞来阐明每种克劳丁的性质和功能是非常困难的，部分原因是我们不能准确地确定某些上皮细胞中表达的所有类型的克劳丁。因此，为了进一步了解claudin和TJ链的结构和功能，L转染系统将继续用于重建TJs，作为敲除每个claudin基因的补充技术。

在证明中添加的注释。位置克隆已确定克劳丁家族的一个新成员（副细胞素-1/克劳丁-16），其突变可导致人类遗传性肾低镁血症（Simon，D.B.，Y.Lu，K.a.Choate，H.Velazquez，E.Al-Sabban，M.Praga，G.Casari，a.Bettinelli，G.Colussi，J.Rodriguez-Soriano，et Al.1999）。副细胞蛋白-1，一种副细胞镁所需的肾紧密连接蛋白²⁺再吸收。科学类. 285:103–106). 这一发现支持克劳丁可能参与TJ链内水孔形成的观点。

我们感谢我们实验室（京都大学医学院细胞生物学系）的所有成员进行了有益的讨论。我们还要感谢吉田女士、福井康夫女士和福鲁斯女士提供的出色技术援助，以及森田康夫博士和索诺达博士（京都大学）分别构建claudin-3表达载体和生产单克隆抗体。

本研究部分由日本教育、科学和文化部向S.Tsukita提供的癌症研究赠款和科学研究赠款（a）支持，部分由Kazato研究基金会向M.Furuse提供的赠款支持。