血糖性状的遗传决定因素与妊娠期糖尿病风险

妊娠会使血糖生理发生显著变化，从而易导致糖耐量异常(1,2). 到妊娠晚期，适应包括餐后血糖升高、胰岛素敏感性降低和胰岛素分泌增强(2,三). 在一些孕妇中，出现异常程度的空腹或餐后高血糖，导致妊娠糖尿病（GDM）的诊断。GDM与母亲及其子女的不良围产期和长期结局相关，包括未来母亲2型糖尿病（T2D）的高风险(4,5). 遗传因素在多大程度上导致妊娠期血糖生理变化和GDM的发生尚不清楚。

在普通人群中进行的多项大型研究已确定与T2D相关的常见遗传多态性(6–8). 通过检测与糖代谢相关的生理特征（血糖特征）的变异关联，包括胰岛素分泌和敏感性，进一步阐明了一些T2D相关变异导致高血糖的机制(9–13). 许多与T2D相关的常见遗传多态性通过直接或间接影响胰岛β细胞的胰岛素分泌发挥作用。因此，β细胞功能障碍的遗传易感性现已被公认为导致T2D发展的关键机制之一(7).

与T2D相比，遗传因素在妊娠期血糖生理和GDM中的作用尚不清楚(14). 此前只有一项关于妊娠期血糖定量特征的全基因组关联研究（GWAS）。在这项研究中，普通人群中与血糖特征相关的五个变异与孕妇的血糖或C肽水平相关；在普通人群中发现了两个与血糖特征无关的变异(15). 在对韩国女性进行的GDM GWAS中，已知与普通人群T2D相关的几个变体与GDM病史相关(16). 之前的两项研究也表明，普通人群中与T2D和/或血糖特征相关的变异构建的遗传风险评分（GRS）与GDM相关(17,18). 然而，以前的研究没有评估基于生理学的遗传变异群体对GDM风险的总体影响。

因此，我们的目的是利用普通人群中血糖性状基因组学的发现来深入了解导致GDM的生理机制。我们检验了以下假设：妊娠期外血糖特征（空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素分泌和胰岛素敏感性）的遗传决定因素也与妊娠期的这些特征相关。此外，我们测试了每个血糖特征的遗传决定因素是否与GDM相关，目的是确定导致妊娠期高血糖的关键生理过程。

妊娠期和生长期葡萄糖调节遗传学（Gen3G）是一项针对加拿大魁北克省谢尔布鲁克市孕妇的前瞻性队列研究，之前由Guillemette等人详细描述(19). 参与研究的女性在怀孕前三个月登记。排除标准包括妊娠早期的显性糖尿病史或实验室证据（糖化血红蛋白≥6.5%或葡萄糖负荷50g后血糖≥185 mg/dL）、多次妊娠和使用影响糖代谢的药物。所有女性在妊娠24至30周期间接受75g口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。舍布鲁克大学医院中心的伦理审查委员会批准了这项研究，参与者给出了书面知情同意书。

高血糖和不良妊娠结局（HAPO）研究是一项国际性的多中心前瞻性母体葡萄糖代谢研究，之前由Metzger等人详细描述(4). 孕妇在妊娠24至32周期间接受了75克的OGTT。排除标准包括已知的糖尿病和多胎妊娠。空腹血糖>105 mg/dL或2小时血糖>200 mg/dL的女性被排除在进一步研究之外。每个HAPO现场中心的机构审查委员会批准了该方案，受试者提供了书面知情同意书。

在Gen3G中，我们使用己糖激酶法（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）测量了空腹和口服葡萄糖后60和120分钟的血糖水平。使用多重粒子流式细胞术分析（Human Milliplex MAP试剂盒；EMD Millipore）在同一时间点测量胰岛素和C肽水平。

在HAPO中，分别使用化学分析仪（VITROS 750；Ortho Clinical Diagnostics）和免疫分析（AutoDELFIA；PerkinElmer）在中央实验室测量葡萄糖（空腹以及葡萄糖后60分钟和120分钟负荷）和C肽（空腹和糖后60分钟负荷）(20).

在Gen3G中，Stumvoll第一阶段估计用于估计胰岛素分泌，Matsuda指数用于估计胰岛素敏感性（与胰岛素抵抗相反）(21,22). 在这两个队列中，还使用HAPO研究中得出的基于C肽的测量来评估胰岛素敏感性(23).

如果参与者的OGTT结果符合2013年世界卫生组织认可的国际妊娠糖尿病协会研究小组的标准，则被归类为患有GDM(24,25).

在Gen3G中，我们使用Gentra Puregene blood Kit（加拿大米西索加省齐根市）从母体血褐色皮毛中分离出DNA。基因组数据来自于魁北克基因组创新中心（加拿大蒙特利尔）的扩展多种族全球阵列（Illumina）。分析中包含的单核苷酸多态性（SNP）的呼叫率>95%，并且没有偏离哈代-温伯格平衡(P（P）> 0.01). 所含样本的呼叫率>98%。对同一受试者的母亲和孩子之间或两次怀孕之间的SNP进行检查；去除了生物学结果不可信的样本。我们使用ShapeIT v2.r7990定相、HRC r1.1 2016参考面板和密歇根插补服务器提供的minimac3软件进行插补。在目前的分析中，我们包括了所有既有基因组数据又有OGTT全糖和胰岛素结果的女性。

在HAPO中，我们从OGTT期间采集的血液中提取DNA。我们在Broad Institute使用Illumina Human610-Quad v1B SNP阵列进行基因分型。基因组数据的质量控制包括删除样本和/或具有男性性别的SNP、染色体异常、样本重复、低呼叫率、孟德尔错误、偏离Hardy-Weinberg平衡、重复不一致和低次要等位基因频率。使用SHAPEIT v.2和IMPUTE2 v.2.3.0以及1000个基因组III期数据插补基因型。在本分析中，我们包括在英国（贝尔法斯特）、澳大利亚（纽卡斯尔/布里斯班）和加拿大（多伦多）注册的欧洲血统女性。

我们研究了150个已知与血糖特征或T2D相关的遗传变异，这些变异来自以前在普通人群中的研究。在葡萄糖和胰岛素相关性状联合会（MAGIC）或DIAbetes遗传复制和荟萃分析（DIAGRAM）联合会数据的荟萃分析中，所有选定的变异与全基因组意义上的至少一个性状相关(8–12).

补充表1–5列出五个GRS中使用的150个SNP。对于空腹血糖和胰岛素GRS，我们根据MAGIC的数据，研究了所有已知的与欧洲人基因组意义上各自特征相关的SNP(9–11). 对于T2D GRS，我们研究了85个已知与全基因组意义上的T2D相关的SNP，以及Udler等人从DIAGRAM中选择的欧洲人中与T2D至少具有名义上显著关联的SNP(26)使用Morris等人的数据(8). 对于胰岛素分泌GRS，我们使用了8个与胰岛素分泌相关的SNP（根据MAGIC OGTT数据中的校正胰岛素反应[CIR]进行测量，可用于多达5318名个体）以及16个来自空腹血糖、空腹胰岛素、，或与相同数据中的CIR具有名义上显著关联的T2D GRS(9,12). 对于胰岛素敏感性GRS，我们在最近的MAGIC GWAS中使用了2个与胰岛素敏感性相关的SNP（通过应用于OGTT数据的Stumvoll胰岛素敏感性指数进行测量），并使用了12个与MAGIC OGTT中Matsuda指数名义上显著相关的空腹血糖、空腹胰岛素或T2D GRS的SNP(12,13).

效应等位基因被定义为空腹血糖升高、空腹胰岛素升高、胰岛素分泌降低或胰岛素敏感性降低等位基因。通过将携带的风险等位基因的数量（0、1或2）乘以MAGIC数据（可用于空腹血糖、空腹胰岛素和Matsuda指数）或图表数据（T2D）中每个变体与相关性状/疾病的关联的效应大小（β），计算每个受试者每个基因座的SNP得分(8,9,12). 对于胰岛素分泌，使用了每个SNP和CIR的效应大小，因为Stumvoll第一阶段评估没有可用的汇总统计数据(12). 将每个性状GRS中SNP的SNP得分相加，以获得受试者每个性状的GRS。对所有GRS进行重标，以使最高可能得分等于所包含SNP数量的两倍，从而在权衡每个等位基因的影响大小后给出更容易解释的“每个风险等位基因”得分；例如，T2D GRS的可能得分范围是0到170。

我们使用未加权的GRS进行了敏感性分析（为每一个空腹血糖或空腹胰岛素升高、胰岛素分泌或胰岛素敏感性降低或T2D风险增加的等位基因分配一个点，不加权），由于在非妊娠个体研究中得出的相对效应大小的假设可能不适用于孕妇。

给定GRS中缺失SNP超过10%的受试者未被分配分数。具有等于或小于10%缺失等位基因的受试者接受了根据缺失SNPs数量进行调整的GRS，使得每个人的最高可能得分等于没有缺失SNPs的个体的最高可能得分。

我们曾经t吨检验（连续变量）和χ²测试（分类变量）以比较每个队列中患有和不患有GDM的女性的特征。我们使用线性回归来测试妊娠24-32周时GRS与相应血糖特征之间的相关性，在OGTT时对BMI、母亲年龄和孕龄进行了多变量调整。以胰岛素分泌（Stumvoll第一阶段估计）作为反应变量的多变量模型也根据胰岛素敏感性（Matsuda指数）进行了调整。我们将C肽水平和HAPO胰岛素敏感性指数转换为z（z）-考虑到不同的C肽分析和测量单位，在分析之前进行评分，以帮助比较两个队列。我们自然对数转换了Gen3G中的空腹胰岛素、Matsuda胰岛素敏感性指数和Stumvoll第一阶段估计值，以满足参数分析的假设。

我们使用logistic回归检验了血糖特征与T2D GRS和GDM之间的相关性，并对OGTT时的BMI、母亲年龄和孕龄进行了多变量调整。

考虑到我们基于假设的方法P（P）值<0.05被认为是显著的。使用R 3.5.1进行分析。

在这两个队列中，与维持正常糖耐量的女性相比，患有GDM的女性年龄较大，BMI较高，血糖水平较高，空腹胰岛素和/或C肽水平较高，胰岛素敏感性较低(表1). 在Gen3G中，患有GDM的女性不太可能初孕。在HAPO中，患有GDM的女性更有可能有糖尿病家族史。在这两个队列中研究的女性主要是欧洲血统。

表2显示了妊娠晚期每种血糖特征GRS与其各自血糖特征之间的关联。

在这两个队列中，空腹血糖GRS与空腹血糖密切相关，并解释了7%的这一特征变异(P（P）= 1.6 × 10⁻¹⁰在Gen3G中，P（P）= 2.7 × 10⁻²³在HAPO中），GRS每增加一个单位，空腹血糖升高约0.4 mg/dL。多元调整后，这种关联持续存在。在Gen3G中，空腹胰岛素GRS与空腹胰岛素增加相关，但在校正包括母亲BMI在内的协变量后，这并不显著(P（P）= 0.12). 空腹胰岛素GRS与空腹C肽无关z（z）-Gen3G评分，但与空腹C肽相关z（z）-多元调整后HAPO得分(P（P）= 0.01).

在Gen3G队列中，胰岛素分泌GRS与胰岛素分泌减少相关，解释了单变量分析中1.3%的这一特征变异(P（P）= 0.007). 胰岛素分泌GRS和Stumvoll第一阶段估计值之间的关系在多变量调整后得到加强，包括胰岛素敏感性(P（P）=3.8×10⁻⁷). 通过Matsuda指数测量，胰岛素敏感性GRS与Gen3G中胰岛素敏感性降低相关，解释了单变量分析中0.6%的这一特征变化(P（P）=0.04）。多元调整后GRS和Matsuda指数之间的关系增强(P（P）= 0.009). 在两个队列中，胰岛素敏感性GRS和HAPO（基于C肽）的胰岛素敏感性指数之间没有显著相关性(P（P）=0.22和P（P）在Gen3G和HAPO中分别为0.40）。

在两个队列中，T2D GRS与GDM相关（Gen3G：调整后的比值比[OR][95%CI]1.06[1.01,1.10]，HAPO:1.03[1.01,1.06]）(图1和补充表6).

在HAPO中，空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素分泌和胰岛素敏感性GRS均与GDM相关，与OGTT时的母亲年龄、BMI和孕龄无关，每增加1个单位，GDM的几率增加6%-14%(图1和补充表6). 在Gen3G中，胰岛素分泌GRS与GDM相关（OR[95%CI]1.14[1.02，1.26]，P（P）=0.02（在多元模型中）(图1). 在Gen3G中，我们没有观察到其他血糖特征GRS和GDM之间的显著相关性，但OR估计值与HAPO中的相似。

未加权GRS与其各自妊娠期特征和GDM的相关性与上述加权GRS的相关性相似或略弱(补充表7和8).

在这里，我们证明，在一般人群中，已知与空腹血糖、胰岛素分泌和胰岛素敏感性相关的基于生理学的遗传变异组会影响妊娠期的血糖特征。在综合评分中评估的空腹血糖升高、空腹胰岛素升高、胰岛素分泌减少和胰岛素敏感性降低的遗传风险等位基因与更高的GDM风险相关。我们的研究表明，尽管妊娠期血糖生理发生了深刻的变化，但妊娠期血糖性状的遗传结构在一定程度上与妊娠外血糖性状的基因结构是相同的。

在之前的GWAS中，包括HAPO和Gen3G参与者，除其他外，我们搜索了与妊娠期空腹血糖和其他血糖特征相关的基因位点，在普通人群中鉴定五个已知与血糖特征相关的基因座和两个仅与妊娠相关的新变异(15). 在之前的研究中，我们发现SNP位于或接近GCKR公司,G6PC2型,PCSK1、PPP1R3B、和MTNR1B公司（全部纳入当前研究的空腹血糖GRS）与全基因组意义上的空腹葡萄糖相关。本研究扩展了这些发现，表明在普通人群中发现的空腹血糖相关遗传变异总体上是妊娠期空腹血糖的一个重要决定因素。根据已发表的报告，我们的空腹血糖GRS对妊娠期空腹血糖的影响与妊娠外空腹血糖报告的影响相似，尽管我们没有数据直接比较相同女性妊娠期内外的影响大小(27,28).

尽管在我们之前的研究中包括了与妊娠期禁食C肽相关的基因座的SNPs(PPP1R3B型和GCKR公司) (15)再加上普通人群中与空腹胰岛素相关的16个其他基因座，仅在HAPO中进行多变量分析后，空腹胰岛素GRS与空腹C肽的相关性较弱；在单变量分析中，空腹胰岛素GRS仅解释了HAPO空腹C肽变化的0.1%。多变量校正后，Gen3G中空腹胰岛素GRS和空腹胰岛素之间的弱相关性不再具有统计学意义。因此，空腹胰岛素/C肽可能存在妊娠特有的遗传和非遗传决定因素。与此一致，我们之前的调查在BACE2公司与妊娠期空腹C肽水平相关的基因座。

胰岛素敏感性和胰岛素分泌的GRS也与Gen3G中的这些特征显著相关，Gen3G可以进行胰岛素测量。虽然已知胰岛素敏感性和分泌在妊娠过程中发生显著变化，但我们的研究表明，非妊娠个体这些特征的遗传决定因素继续影响妊娠期的血糖生理学。还需要进一步研究，以确定是否存在对妊娠相关血糖生理学的显著纵向变化具有特定影响的遗传变异。

所观察到的T2D相关变异与GDM风险之间的显著相关性与先前研究的结果一致。一项对有GDM病史的女性进行的研究使用了无偏见（GWAS）和基于假设的方法，发现许多T2D相关等位基因与GDM相关(16). 之前的调查，由Lowe等人审查(14)，已检查了一些已知的个体T2D相关变异与GDM风险的相关性，并发现阳性结果（包括当前研究中包含的位点SNPs：CDKAL1、IGF2BP2、TCF7L2、KCNQ1、MTNR1B) (29,30). 最后，之前的两项研究使用GRS来测试T2D易感性等位基因是否也与GDM相关，发现与此处观察到的结果一致(17,18). 值得注意的是，一些先前进行的研究使用了有GDM病史的病例人群和对照人群，这些人群在妊娠期外没有葡萄糖不耐受，但没有已知的妊娠史，这可能会使结果产生偏差(16,18). 尽管存在这些潜在的偏见，但我们的结果支持先前研究的结论。

虽然之前的研究已经检测了已知与妊娠外血糖特征相关的个体遗传变异，但据我们所知，我们是第一个证明GDM与决定空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素分泌、，和胰岛素敏感性。我们的观察结果支持了这样一种假设，即妊娠期间出现的胰岛素分泌或敏感性的慢性缺陷至少会导致GDM的一部分风险。尽管先前有人认为GDM患者主要存在胰岛素分泌的遗传缺陷，但我们的数据表明GDM的遗传易感性也涉及胰岛素敏感性的遗传缺陷。

当前研究的优势包括在每个评分中使用所有已知的血糖特征相关变量、每次妊娠中的血糖生理特征，以及在妊娠期间使用同期对照受试者进行客观血糖测量。局限性包括HAPO参与者缺乏胰岛素测量，与旨在检测非妊娠个体常见遗传变异的研究相比，样本量较小；这限制了演示小规模关联的能力，尤其是在Gen3G中。HAPO研究的设计可能导致严重GDM的女性被排除在外，进一步降低了权力；尽管如此，我们还是能够在这个队列中检测到我们的每个GRS和GDM之间的显著关联。最后，没有数据可用于推导胰岛素分泌GRS中Stumvoll第一阶段估计的特异性权重；然而，与Stumvoll估计值一样，CIR是衡量胰岛素对葡萄糖负荷早期反应的指标，两者都与金标准测量值高度相关(22,31,32).

总之，我们的研究结果表明，一般人群中空腹血糖、胰岛素分泌和胰岛素敏感性的遗传决定因素影响妊娠期的这些特征；特别是，空腹血糖似乎在怀孕和非怀孕状态之间有很大的共同遗传结构。此外，携带空腹血糖升高、空腹胰岛素升高、胰岛素分泌减少或胰岛素敏感性降低等位基因的女性患GDM的风险更高。临床上，基于常见遗传变异的精确方法（目前正在考虑用于T2D的预防和治疗）也可能适用于妊娠期高血糖症。

基金。C.E.P.得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）（K23DK113218）和罗伯特·伍德·约翰逊基金会哈罗德·阿莫斯医学院发展计划（74256）颁发的职业发展奖的支持。L.B.是来自魁北克省圣徒基金会的初级研究学者。J.C.F.由NIDDK（K24DK110550）支持。M.-F.H.获得美国糖尿病协会路径加速器奖（1-15-ACE-26）的支持。HAPO队列中的工作得到了国家卫生研究院的资助尤妮丝·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发展研究所（HD-34242和HD-34243）、国家人类基因组研究所（HG-004415）和NIDDK（R01DK097534）。

利益的双重性。没有报告与本文相关的潜在利益冲突。

作者贡献。C.E.P.撰写了手稿，所有作者都对手稿进行了审查和编辑。C.E.P.、M.V.L.、D.M.S.、W.L.L.和M.-F.H.提出并设计了该研究。C.E.P.、M.N.、O.T.、C.A.、C.B.和D.M.S.参与了数据分析。C.E.P.、L.B.、J.C.F.、D.M.S.、W.L.L.和M.-F.H.对数据解释做出了贡献。P.P.、L.B.、D.M.S.、W.L.L.和M.-F.H.参与了数据收集。W.L.L.和M.-F.H.分别是Gen3G和HAPO这项工作的担保人，因此，他们可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。

之前的演示。2016年6月10日至14日，在洛杉矶新奥尔良举行的美国糖尿病协会第76届科学会议上，以摘要形式介绍了本研究的部分内容。