本研究的优点和局限性
我们对来自不同地区的两个西班牙人群进行了研究，这两个人群具有明显不同的特征，尽管两者的结果相似。
本研究中包含的个体数量有限，但其统计能力足以减少我们分析的多态性数量。
我们没有彻底研究该基因的遗传变异性，因为该基因区域有太多变异，需要研究更多多态性。
我们的结果应该得到其他研究的证实，这些研究包括对不同人群和较大样本量的分析。
介绍
肥胖是一种由于能量摄入和能量消耗之间的长期不平衡而导致身体脂肪组织中积聚多余能量的状态1; 由于不同的遗传背景，个体对这种不平衡的反应不同。2在过去20年中，超重和肥胖的人数急剧增加。这尤其令人担忧，因为肥胖会显著增加患慢性病的风险，如2型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、结肠癌和阻塞性睡眠呼吸暂停。三
肥胖被定义为一种以细胞因子产生增加为特征的低度炎症状态。4肥胖患者的白细胞介素-18（IL-18）浓度增加，表明其通过增加脂肪生成参与肥胖和代谢综合征。5IL-18是IL-1细胞因子超家族的成员。它调节免疫反应，并在参与慢性炎症、自身免疫性疾病和几种癌症和传染病的细胞中表达：巨噬细胞、树突状细胞、枯否细胞、角质形成细胞、成骨细胞、肾上腺皮质细胞、肠上皮细胞、小胶质细胞和滑膜成纤维细胞。6–14IL-18信号传导是通过这种细胞因子与一种名为IL-18R的异二聚体受体结合而诱导的。IL-18R由两条链组成，IL-18R1（具有结合作用）和IL18RAP（具有信号传递作用的受体辅助蛋白）。两条IL-18R链的相互作用是诱导IL-18信号传导的必需条件。15–17
一些多态性可以通过不同的机制调节基因活性，例如修改特定microRNAs（miRNAs）的结合或作用。它们是小的非编码RNA，可以调节数千个基因的表达，过去十年的研究表明它们参与了疾病调控。18 19一些miRNAS被描述为癌症、心血管疾病和2型糖尿病的生物标记物。18 20–22此外，有人认为，miRNA调节的失败在肥胖中起到了一定作用。23这些事实支持将miRNA用作慢性病早期诊断的生物标记物和治疗靶点。24
许多研究报告了IL-18和IL18R1，但很少专门讨论IL18RAP；因此，我们首次调查了IL18RAP、体重指数（BMI）和肥胖之间的可能联系。为此，我们验证了位于MIR136结合位点的多态性rs7559479对IL18RAP系统以及该基因的mRNA水平。
材料和方法
人口样本
我们分析了来自西班牙两个不同地区的两个基于普通人群的研究样本（共1970人）：VALCAR研究（来自瓦伦西亚地区的468名受试者）和Hortega研究（来自Valladolid省的1502名受试人）。最初收集VALCAR和Hortega样本是为了研究普通人群的心血管风险和心血管疾病的发展。霍特加样本包括来自代表巴利亚多利德省一半地区的医疗当局地区的受试者，而VALCAR患者来自巴伦西亚克里尼科大学医院覆盖的卫生当局地区。Hortega研究由Río Hortega-医院伦理委员会批准，VALCAR研究以及此处提出的遗传学研究由巴伦西亚Clinico大学医院伦理委员会审批。所有参与者都签署了知情同意书。这项研究是根据世界医学协会的道德准则（赫尔辛基宣言）进行的。
使用标准程序收集人口数据（年龄和性别）和人体测量参数。肥胖、高血压（HTN）和2型糖尿病（根据WHO标准定义）的存在；网址：http://www.who.int)记录BMI（kg/m2)已计算。简言之，当BMI≥30 kg/m时诊断为肥胖2当收缩压和舒张压分别大于140和/或>90 mm Hg时，诊断为HTN，糖尿病定义为空腹血糖水平>7.0 mmol/L（126 mg/dL）或2小时血糖水平>11.1毫摩尔/升（200毫克/分升）。此外，还记录了之前的2型糖尿病或HTN诊断以及采集样本时的疾病检测结果。所分析样品的一般特征如所示表1.
排除标准在两个人群中都是相同的：存在严重的身体状况，使受试者无法对调查做出反应或捐赠所需的样本，可能影响可靠信息收集的疾病，或任何可能使受试者参与研究变得复杂或阻碍其参与的心理或社会状况。排除患者的决定是由临床医生根据个人情况做出的。
SNP选择和基因分型
在含有EDTA的试管中采集静脉血样本，以便使用Chemagic系统（德国贝斯韦勒Chemagen）获取基因组DNA。DNA被量化并稀释至最终浓度100 ng⁄µL。这个IL18RAP系统根据SYSNPs网络工具中选择的几个参数的结合，选择单核多态性（SNP）进行基因分型25：高加索人群的杂合性（次要等位基因频率>10%）、基因的位置和间距以及可能的功能效应(http://www.ensembl.org/index.html). 五个SNPIL18RAP系统已选择基因(表2)根据制造商的指南，使用寡核苷酸连接分析（SNPlex；Applied Biosystems，Foster City，California，USA）进行基因分型。所选SNP的基因组信息来自Ensembl 89版，单核苷酸多态性数据库（dbSNP）构建149。
表2 从中选择的多态性特征IL18RAP系统基因（集合ID:ENSG00000115607）
统计分析
在研究之前，我们使用GAS功率计算器对样本量较小（分布在病例和对照组中）的所选多态性（次要等位基因频率=0.10）的选择标准中包含的较低频率估计了统计功率(http://csg.sph.umich.edu/abecasis/gas_power_calculator/index.html). 我们认为P值为0.01（基于多次比较）。一阶段研究中，OR=2.5的统计功效为91.9%。对整个样本应用相同的标准，OR=1.5的统计功效为0.975。
基因分型后，将基因分型结果较差（<90%）的样本剔除用于所有SNP分析。所有定量值均表示为平均值±SD或定性变量的百分比。方差分析用于比较各组之间的定量变量，χ2测试用于分类变量。使用SPSS统计软件22.0版和SNPStats计算每个SNP的等位基因和基因型频率(http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats网站). 哈迪-温伯格平衡（HWE）用χ检验2使用SNPStat软件进行单自由度分布。所有分析的多态性均保持HWE。
首先在SPSS和SNPStat中使用共显性遗传模型，然后在两种基因型具有相似平均值的情况下使用其余模型，检验了多态性与人体测量参数、BMI作为数量性状和肥胖作为质量性状之间的关联。方差分析用于比较基因型之间连续变量的平均差异。肥胖与每种多态性之间的关联，以及在适当的情况下，单倍型之间的关联，使用逻辑回归模型进行了测试。使用R2统计数据计算连锁不平衡测量值。比值比用于评估每个多态性存在肥胖的风险，年龄和性别被用作两个潜在的混杂协变量。
MiRNA靶点预测
因为rs7559479多态性位于il18说唱基因，microRNA.org工具（2010年8月发布）用于预测microRNA靶点。
细胞系和质粒
HuH-7细胞是一种永生上皮样致瘤细胞系，用于miRNA分析。细胞在含有10%胎牛血清、L-谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，并在37°C和5%CO的湿润环境中生长2.pEZX-MT05控制报告人，包含IL18RAP系统从GeneCopoeia购买的3´-UTR具有最常见的rs7559479 A等位基因多态性或rs755947 9 G等位基因多样性，以及pEZX-MR04对照报告基因和MIR136报告基因。
转染和荧光素酶报告试验
转染前一天将HuH-7细胞接种在六孔板中，使用时融合率为70-90%。根据制造商的说明，使用磷酸钙ProFection哺乳动物转染系统试剂盒（美国麦迪逊Promega）进行转染。转染72小时后，我们收集培养基，并根据制造商的说明，使用Secrete-Pair双荧光检测试剂盒（美国Rockville的GeneCopoeia）测量Gaussia荧光素酶和分泌的碱性磷酸酶活性。使用Perkin Elmer Wallac 1420 VICTOR2多标签计数器测量发光度。
结果
研究人群的特征
之间的关联IL18RAP系统在VALCAR人群中首次发现了基因多态性和肥胖特征，随后在Hortega研究中也发现了类似的结果；当我们一起分析两个样本时，这种关联仍然存在。两个样品的主要特征如所示表1VALCAR研究包括468名个体（24.8%肥胖；47.2%男性），Hortega研究包括1502名受试者（23.7%肥胖；49.5%男性）。
之间的关联IL18RAP克基因多态性与肥胖特征
所有分析的多态性均在HWE中。在IL18RAP系统基因rs2293225、rs2272127和rs7559479与肥胖相关。我们关注的是rs7559479，因为它是与肥胖关系最密切的一个。在合并人群中，G等位基因的存在与较高的肥胖风险（P=0.0024，OR=1.44）和BMI值（P=0.008）相关(表3)并且与每个个体人群的肥胖风险显著相关。我们仅在VALCAR人群中发现rs2293225和rs2272127的相关性：rs2293225中的T等位基因与较低的肥胖风险（P=0.036；OR=0.60）和较低的BMI值（P=0.0038；OR=1.41）相关，而rs227227中的G等位基因则与较低肥胖风险相关（P=0.028；OR=0.66），但与BMI值无关。这些关联总结于表4.
表3 肥胖与体重指数（BMI）和rs7559479多态性之间的关联，根据两个样本的年龄和性别进行调整（BMI值为平均值±SE；“%非肥胖”表示携带AA或AG-GG基因型的非肥胖受试者的%，“%肥胖”表示携带AA或AG-GG基因型的肥胖受试者的%；粗体表示重要性）
表4 在中找到的关联的摘要表IL18RAP系统基因（粗体表示意义）
单倍型分析
我们对rs2272127、rs2293225和rs7559479变异进行了单倍型分析，这些变异都具有高度连锁不平衡（D´>0.90）。CCG单倍型（表5)与肥胖风险较高（P<0.0015）和BMI（P<0.0088）相关。该单倍型包括在每个变异中发现的风险基因型，在整个研究人群中23%的个体中存在。
表5 人群中rs2272127、rs2293225和rs7559479的单体型关联分析IL18RAP系统根据年龄和性别调整体重指数（BMI）和肥胖风险的基因
MIR136与IL18RAP系统3’-UTR
我们的分析表明，rs4851581、rs2293224、rs229225和rs2272127多态性(http://www.ensembl.org/index.html)没有明确的功能效果；然而，rs7559479位于IL18RAP系统在MIR136 miRNA-结合区(http://microrna.org). 这种变异可以改变这种miRNA的结合，因此可以影响IL18RAP系统mRNA。因此，它也可能影响IL-18的下游成脂作用，并可能参与BMI调节。
为了阐明rs7559479 SNP对IL18RAP系统mRNA MIR136结合位点，我们对HuH-7细胞进行了体外研究。使用了五种质粒：对照报告人pEZX-MT05，一名含有IL18RAP系统具有rs7559479 A-或G-等位基因多态性的3´-UTR、对照pEZX-MR04报告子和MIR136报告子，以及表达分泌型碱性磷酸酶的质粒作为转染对照。表达水平表示为两种酶活性之间的比率。图1A在含有il18说唱在没有MIR136的情况下，具有rs7559479 A等位基因和G等位基因多态性的3´-UTR。图1B表明含有这些基因的记者的联合转染il18说唱3´-UTR rs7559479多态性与MIR136报告基因一起对G等位基因产生了显著更高的信号（P<0.05），这意味着该SNP的miRNA结合低于a等位基因多态性。因此，A等位基因（与较低的肥胖风险相关）增加MIR136结合，因此可能减少IL18RAP蛋白的产生。图2显示了根据Piletić和Kunej提出的MIR136和rs7559479之间相互作用的特征。26
图1 使用不同的报告器和组合对rs7559479（MIR136靶点）进行荧光素酶分析。使用的报告人分别为：rs7559479多态性A等位基因（1）、rs755947多态性G等位基因2）、对照报告人pEZX-MT05（3）、MIR136（4）和对照报告人pEZX-MR04（5）。数据表示为平均值±SE。记者4、5和细胞均为阴性对照。
图2 MIR136与IL18RAP。显示了使用MicroRNA.org工具预测的MicroRNA靶点；灰色底座对应于rs7559479多态性的位置。
讨论
在这项基于人群的研究中，我们检查了五项IL18RAP系统基因多态性与IL-18脂肪生成信号通路相关，并发现rs7559479 AG-GG基因型与较高的BMI和肥胖风险相关。特别值得注意的是，尽管Hortega和VALCAR种群具有不同的特征，但这两个种群的研究结果都是重复的；此外，当我们研究混合人群时，这种与BMI值和肥胖之间的联系变得更加紧密。如中所述表4，一个与肥胖风险较高相关且在人群中常见的单倍型与个体多态性分析中获得的数据一致（rs2272127、rs2293225和rs7559479的单倍体CCG）。这些结果加强了IL-18级联反应可能参与BMI调节和肥胖的观点。
这些关系在以前的全基因组关联研究中没有发现，但这可能是研究人群中不同环境因素（如营养）的结果。地中海种群可能与其他种群存在特殊差异，尤其是因为它们在全基因组关联研究中通常被低估，而该研究通常不包括任何西班牙样本。27–29然而，一项研究分析了西班牙人群中22个肥胖相关基因位点，发现只有自由贸易组织该基因与BMI明显相关。30考虑到肥胖的高遗传性，很可能仍有新的变异有待发现，尤其是在西班牙/地中海人群中，多态性似乎没有文献中描述的那样产生同样的影响。
之前的研究没有描述体重增加或肥胖与我们在本研究中建立的rs7559479单核苷酸多态性之间的关系。然而，肥胖与炎症密切相关31并且增加的IL-18浓度被认为在肥胖和代谢综合征中发挥病理生理作用。32
我们描述的关联很重要，因为rs7559479位于IL18RAP系统该基因是MIR136靶点。我们使用功能分析证明，a等位基因与较低的肥胖风险相关，可降低IL18RAP系统MIR136已被广泛研究，尤其与多种癌症有关，例如通过调节胶质瘤细胞对不同治疗的敏感性，33 34在人非小细胞肺癌细胞中35肺腺癌细胞的转移相关特征。36尽管MIR136在脂肪细胞中不表达，37 38由于其在脂肪分化中的作用，is与肥胖有关39及其在下丘脑神经元中的表达，参与食欲和全身能量平衡控制。40此外，据我们所知，这是首次验证MIR136:IL18RAP目标对。
与其他候选基因相比，炎症细胞因子基因与肥胖之间的相关性研究较少。在人类中，循环IL-18水平与BMI、肥胖和代谢综合征疾病呈正相关。41–45这一发现与肥胖患者脂肪组织中脂肪因子释放增加相一致，因此，脂肪组织中的单核细胞/巨噬细胞系细胞是循环IL-18的主要来源。46此外，肥胖人的脂肪细胞分泌的IL-18是瘦人的三倍47肥胖和代谢综合征患者皮下脂肪组织中IL-18的表达升高。41 44 48 49与代谢状态信号一致，循环IL-18水平因高血糖或高脂肪饮食而升高，42 50间歇性葡萄糖暴露增加脂肪细胞分泌IL-1851; 相反，减肥和锻炼会降低IL-18水平。41 44 50一些脂肪因子（如瘦素）的水平随着肥胖而增加，它们通过负反馈反对正能量平衡。52 53有趣的是，肥胖或2型糖尿病患者的白细胞对IL-18具有抵抗力，这可能会让人想起肥胖相关的瘦素抵抗。54此外，IL-18基因或其受体的多态性与肥胖有关55和代谢综合征障碍56–58在人类中。然而，IL-18的总损失59–61通过其他途径具有相反的效果（脂肪生成失调、食欲抑制和能量消耗）。
我们的数据表明，IL18RAP的减少可以降低BMI和肥胖；这可能是由于IL18RAP介导的IL-18促炎信号的减少所致。62 63此外，这些多态性在MIR136表达期间对细胞的影响很重要，例如，因为它们对细胞分化和调节的潜在影响。因此，未来的研究应旨在阐明IL18RAP介导BMI和肥胖风险降低的途径。如前所述，有人认为IL-18是一种与过度肥胖相关的脂肪细胞因子。4此外，IL18RAP通过IL-18受体增强IL-18结合活性，并在IL-18信号传递中发挥作用。因此，尽管之前没有相关研究IL18RAP系统对于肥胖，我们的研究结果表明，该基因的多态性可能会改变个体对肥胖的易感性。虽然这项研究的受试者数量有限，但其统计能力足以减少我们分析的多态性数量。然而IL18RAP系统肥胖表型中的SNP应通过其他研究进行确认，包括对不同人群和较大样本量的分析。
