Emmanouil Metzakopian是剑桥大学英国痴呆研究所的组长，也是bit.bio的研发副总裁。他在Open Targets领导多个神经科学项目，其中之一最近发表了一项基因筛选，旨在寻找抑制作用可以保护神经元免受细胞应激的基因 [1].
我请他告诉我更多关于该项目及其对神经退行性疾病靶点识别和优先排序的影响。
主要调查结果
在这个项目中，该团队创建了一个Cas9 iNeuron系来进行基因筛查，并使用CHOP基因报告器来测量细胞所经历的被膜霉素诱导的内质网（ER）应激水平。由此，他们验证了KAT2B是一种基因，通过CRISPR-Cas9敲除或L-Moses的药物抑制，该基因对内质网应激具有神经保护作用。
你是怎么想到这个项目的？
阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的主要特征是错误折叠蛋白质的积累，这会导致细胞应激，尤其是与该项目相关的内质网应激。
这激活了一种称为“展开蛋白反应”的机制，如果损伤太大，细胞就会死亡，神经元就会丢失。神经退行性疾病的一个治疗角度是抑制未折叠蛋白反应以拯救神经元。
作为Wellcome Sanger Institute的研究员，我接受了基因和细胞工程以及基因筛选方法的培训，包括CRISPR-Cas9。在开始我的实验室后不久，我与OpenTargets一起进行了一个项目，以确定调节CHOP表达的基因，CHOP是未折叠蛋白反应中的一个关键基因。
但事实上，刚刚发表的项目——由我实验室的博士后Sofia Pavlou执行——是我们最初想法的一个有趣分支，我们决定将其作为一个附带项目来进行。
你希望找到什么？
该项目的目的是寻找保护神经元免受毒性内质网应激的基因。这补充了我之前在氧化应激和脂质过氧化等其他应激途径方面所做的工作。霉素是一种化合物，可导致细胞内未折叠蛋白的积累，从而导致内质网应激。
如果我们能找到一种基因，当它被敲除或敲除时，可以使细胞存活或适应更高的应激水平，那么这种基因就成为一种潜在的靶点，用于保护细胞，尤其是神经元，免受细胞应激源的伤害。
据我们所知，这是第一次对iPSC衍生神经元进行筛选，目的是确定对衣霉素具有神经保护作用的敲除物。
你最大的挑战是什么？
我们最大的挑战是选择一个合适的模型来筛选保护基因。我们希望这与人类的情况尽可能接近，所以我们使用了iPSC衍生的谷氨酸能神经元，即所谓的iNeurons，使用Mark Kotter实验室的OPTi-Ox技术重新编程[2]我们之前已经表明，与直接分化相比，重新编程可以创建具有较少批间差异的均匀细胞群[3]这种同质性使得更容易识别数据中与疾病相关的信号。
事实上，这个过程的速度和容易程度让我们感到惊讶。我们没想到重编程会比直接分化简单得多，也快得多。与几个月相比，我们在几天、几周内就有了细胞。
重新编程的另一个优点是可伸缩性。你需要数亿个细胞来筛选整个基因组；即使只是筛选可用药的基因组也需要数千万个细胞。
可药基因组
可药性基因组是所有编码蛋白质的人类基因的子集，这些蛋白质可以被小分子或抗体药物靶向[4]这包括已经成为批准和临床阶段药物靶点的基因、与批准药物靶点类似的基因、编码分泌蛋白和细胞外蛋白的基因，以及关键药物基因家族的成员。
你是如何实施这个项目的，你发现了什么？
一旦我们有了我们的细胞模型，我们通过将Cas9敲入一个看家基因进行筛选：这是一个在细胞中高度表达的基因，不太可能沉默，并且在重编程过程中保持不变。然后，我们针对可用药基因组设计了自己的CRISPR引导RNA库，并将相应的慢病毒转导到数以百万计的iNeuron中。在用衣霉素处理细胞以诱导内质网应激后，我们寻找与未处理细胞相比在处理后存活的细胞中富集的导向RNA。
从中，我们确定了188个朝着正确方向发展的基因，并将重点放在13个具有统计学意义的基因上，寻找能够模拟基因敲除效果的小分子抑制剂。我们发现了L-Moses，一种针对KAT2B的化学探针。
用衣霉素和L-Moses联合处理细胞，重现了CRISPR-Cas9筛选的结果：KAT2B的药理抑制以剂量依赖性的方式保护细胞免受衣霉素诱导的内质网应激。
KAT2B在神经元中有两个功能：它在基因组中产生表观遗传修饰（乙酰化），并作为转录因子。利用转录组学和蛋白质组学，我们发现L-Moses影响KAT2B的转录因子活性。事实上，用L-Moses处理的细胞转录水平总体较低。
更进一步，通过使用荧光报告物研究CHOP的表达水平，我们发现，如果用L-Moses处理细胞，那么经衣霉素处理的细胞中CHOP的水平较低。换句话说，用L-Moses处理的细胞存活下来是因为它们经历了较低水平的内质网应激。
这项研究的下一步是什么？
我们没有机会做的一个实验是在疾病小鼠模型和人类类器官上测试L-Moses，看看它是否是一种延缓或阻止神经退行性变的合适药物，尤其是在我们知道涉及内质网应激的情况下。我希望有人阅读并尝试这项工作，你永远都不会知道——如果我们的工作能够产生一些对神经退化具有保护作用的东西，那将是令人惊讶的。
更广泛地说，在这个领域，虽然神经退行性变的迹象在生命后期出现，但我们不知道它实际上是什么时候开始的。该领域正在积极致力于识别良好的生物标记物和遗传测试，以检测疾病的易感性，从而我们可以找到一个窗口，在这个窗口中，治疗可以减少痴呆症的发病率，而不是在出现症状后立即治疗。
一旦我们确定了生物标记物和已知的易感基因，我们就可以开始对患者进行分层，并进行更有针对性的临床试验。因此，如果对L-Moses进行人体试验，它可以用于最有可能缓解神经退化的特定患者群体。
你还有什么要补充的吗？
我想说的是，我们之所以能够出版这样的作品，是因为Open Targets、合作伙伴的精彩互动和热情，以及您从头到尾为研究人员提供的支持。为此，索菲亚和我只想说一声非常非常感谢你。
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