评估基底膜硬化对肾小管上皮细胞影响的肾近端小管模型

摘要

肾小管由一层上皮细胞组成，由肾小管基底膜（TBM）支撑，这是一层特殊的细胞外基质（ECM）。ECM的机械特性对于调节包括增殖、分化和细胞存活在内的广泛细胞功能非常重要。ECM僵硬度增加在促进多种病理状况，包括癌症、纤维化和心脏病方面发挥了作用。TBM机制的变化如何调节肾小管上皮细胞的行为尚不完全清楚。这里我们介绍一种利用体内-衍生TBM以研究肾近端小管细胞中的细胞-基质相互作用。使用生物相容性交联剂genipin控制基底膜力学。Genipin修饰导致基质硬度的剂量依赖性增加。交联对TBM的扩散分子传输特性有轻微但具有统计意义的影响，可能是由于孔径减小。天然和京尼平修饰的TBM底物均支持肾小管上皮细胞生长。细胞能够附着和增殖，形成融合的单层。管状上皮细胞极化并组装有组织的细胞-细胞连接。Genipin修饰对细胞活性和增殖的影响最小。Genipin硬化的TBM增加了原纤维细胞因子的基因表达，改变了近端小管上皮特异性细胞-细胞连接标记物N-钙粘蛋白的基因表达。本工作介绍了一种用于细胞膜机械生物学研究的新细胞培养模型，该模型利用体内-衍生基底膜。我们还证明，TBM硬化通过改变细胞特异性分化标记物的基因表达和诱导原纤维生长因子的表达增加来影响肾小管上皮细胞功能。

简介

健康成年人的肾脏每天过滤约180升液体。大部分水随后被肾小管重新吸收，以浓缩尿液并保持液体平衡。肾小管还负责调节盐、葡萄糖、氨基酸和其他溶质从原发性肾小球滤液中的再吸收，同时保留代谢废物以便在尿液中清除。这是通过肾小管上皮的顶端和基底外侧极化来实现的，因此从肾小管腔到循环的跨细胞和细胞旁运输都受到严格调节，反之亦然[1–3]. 小管不同段的特殊转运蛋白具有不同的功能，导致水和溶质的再吸收，以及毒素和代谢废物在尿液中的排泄[4,5].

肾小管上皮损伤是两种急性疾病的特征[6,7]和慢性肾损伤[8,9]. 肾小管间质纤维化是肾损伤发展为终末期肾病的共同途径[10]. 肾损伤导致上皮细胞脱分化、凋亡和细胞周期阻滞。此外，肾小管损伤导致原纤维细胞因子的产生，以及肾小管和间质间室之间的相互干扰，从而推动成纤维细胞向肌成纤维细胞过渡，并导致慢性损伤和纤维化[11]. 肾纤维化的特征是细胞外基质（ECM）的显著重塑[12]. 肾小管间质损伤导致正常基质成分的上调，如IV型胶原和纤维连接蛋白，以及包括I型、III型和V型胶原在内的纤维性胶原的沉积，这些胶原通常在健康肾脏ECM中含量较低[8,13].

小管上皮细胞固定在一个薄的小管基底膜（TBM）上，通过细胞ECM受体提供结构支持和生物线索，ECM受体调节包括增殖、迁移和存活在内的多种细胞功能[14,15]. 基底膜的结构变化是多种慢性肾脏疾病的特征。Alport综合征和Pierson综合征分别由IV型胶原和层粘连蛋白基因突变引起的肾小球基底膜（GBM）破坏[16]. GBM和TBM增厚是糖尿病肾病的标志[17–19]. 这可能是由于基底膜成分（包括IV型胶原和层粘连蛋白）表达增加所致[20]，通过酶和非酶机制增加基质交联[21,22]降低了对蛋白水解降解的敏感性[23]. 尽管GBM增厚被认为具有潜在的病理意义[24]，较少关注TBM改变在疾病进展中的潜在作用。

大多数粘附细胞，包括肾小管上皮细胞，对其细胞培养基质的机械特性变化作出反应在体外改变合成聚合物底物的硬度会影响细胞增殖、紧密连接、近端小管特异性分化标记的表达以及细胞对生长因子的反应[25–27]. 聚丙烯酰胺凝胶上的原代人肾小管细胞显示，与硬基质相比，在软基质上长时间生长时，关键转运蛋白的基因和蛋白表达增加。此外，生长在硬基质上的细胞显示Smad-2磷酸化增加，表明促纤维化转化生长因子β（TGF-β）信号[27]. 基质硬度也会改变肾上皮细胞对原纤维化生长因子的反应。在硬底物上生长的肾上皮细胞在暴露于外源性TGF-β后更容易去分化，而在软底物上的细胞更容易凋亡[28].

最近的研究表明体内细胞外基质（ECM），包括粘弹性和应变增强，是细胞功能的重要驱动因素，大多数合成细胞培养底物无法重现[29]. 此外，合成水凝胶不能概括基底膜的组成复杂性，基底膜由许多相互作用的蛋白质组成，调节细胞行为[30–32]. 为了解决这个问题，我们开发了一个体外使用直接从肾组织中提取的TBM复制基底膜硬化模型，以复制体内微环境。真空辅助将隔离的TBM压实在合成膜上，以形成适合细胞培养的薄层TBM。Genipin用于控制TBM的机械性能，并导致基质刚度的剂量依赖性增加。基于扩散分子传输分析，TBM基底没有明显缺陷，京尼平改性对TBM孔结构有可测量的影响。小鼠肾近端小管上皮细胞在天然和京尼平修饰的TBM上附着和增殖。细胞极化，并在顶端细胞-细胞连接处显示F-actin和N-cadherin（NCAD）的定位。京尼平修饰对细胞活性或增殖的影响最小。我们发现，强化TBM诱导生长因子的基因表达增加，已知这些生长因子在慢性肾脏疾病中起促纤维化作用。僵硬TBM也诱导NCAD基因表达上调。本研究引入了一种新的生物工程细胞培养系统来研究细胞膜的机械生物学，并表明TBM硬化可能在促进慢性肾脏病肾小管损伤中发挥作用。

材料和方法

肾皮质去细胞化及其特征

猪肾脏取自6个月大的约克郡猪（Lampire Biologicals）。用食物切片机将肾脏切成矢状切面，并进行检查以确保只分离出皮层组织。将皮层切片置于1%十二烷基硫酸钠（SDS）和0.02%叠氮化钠中，轻轻搅拌。每天更换SDS，直到肾脏呈半透明状态，且没有残留细胞物质的迹象。然后将脱细胞的皮层在去离子水中洗涤三次1小时，然后洗涤四次过夜以除去残留的SDS。用4%多聚甲醛固定去细胞前后的肾皮质，石蜡包埋，切片，用标准组织学技术进行苏木精伊红染色。

天然和京尼平修饰肾皮质的特征

如前所述测量胃蛋白酶溶解度[35]. 将天然和京尼平修饰的皮质基质在0.5 M乙酸中以1:250重量/体积比（ECM：胃蛋白酶）与1 mg/ml胃蛋白酶均质。样品在4°C下持续搅拌消化24小时。未消化部分通过离心法造粒。将可溶性部分浓缩在SpeedVac（Thermo Scientific）上。在110°C下，在6 M盐酸中完全水解可溶和不可溶部分。用氯胺T法测定可溶和不可溶部分中的羟脯氨酸含量[36]. 胃蛋白酶的溶解度取可溶性组分中羟脯氨酸含量与可溶性和不溶性组分中羟脯氨酸总含量的比值。将数据归一化为对照组的平均值（未修改的皮层ECM）。

将去细胞ECM在0.18%过氧乙酸（PAA）和4.8%乙醇中消毒30分钟[37]. 为了评估无菌性，样品在37°C的无抗生素培养基中培养7天，并对样品的污染迹象进行定性评估。在灭菌前后测量硬度，以确定灭菌过程是否对基质硬度有任何显著影响。

管状基膜基底的制备与表征

皮质基质主要是TBM，占皮质体积的大部分（≈90%）[38]. 为了进一步纯化皮层ECM并创建适合上皮细胞培养的膜，使用组织匀浆器将皮层ECM切碎，然后通过250μm筛去除大颗粒。在成像研究中，使用75μm筛网进行额外筛分，以去除肾小球和任何其他大颗粒，并为成像提供一个平坦的表面。所得基质为高纯度的TBM。细胞培养基质是通过将TBM压在搅拌细胞中的Transwell膜上而制备的(图1a). Transwell膜在低压侧用尼龙网支撑，以避免在加压过程中使膜变形。将Transwell插入一个3 ml搅拌过的细胞中，并用硅胶o型环密封。将TBM（250μl，湿重0.5 g/ml）装入Transwell膜的顶部室中，并在5 psi的压力下紧贴Transwell薄膜30分钟。所有基质均用PAA灭菌，并用无菌PBS每天清洗五次，持续2天。然后将底物与0.1 mg/ml脱氧核糖核酸酶I（Alfa Aesar J62229）在缓冲溶液（10 mM Tris–HCl，10 mM CaCl）中孵育₂和10 mM氯化镁₂pH7.5），在37°C下放置24小时，以去除残留DNA。在细胞培养之前，用无菌水广泛清洗基质。用无菌京尼平处理TBM基质子集24小时，处理方式与脱细胞ECM相同。

为了评估TBM的形态并确认基底膜的结构成分被保留，通过共聚焦显微镜对基底进行成像。TBM中IV型胶原和层粘连蛋白的染色方式与前面描述的相似[34,35]. 简单地说，将样品固定在4%多聚甲醛的冰上20分钟，然后用5%的山羊血清清洗并封闭1小时。用1:200稀释的层粘连蛋白（Abcam ab11575）和IV型胶原蛋白（Abcam ab6586）的一级抗体探测TBM底物。用PBS洗涤TBM，并将1:200稀释的Alexa Fluor 555（Invitrogen A21428）或488（A110088）山羊抗兔IgG二级抗体偶联物分别用于层粘连蛋白和胶原IV的成像。从Transwell嵌件上取下膜，并将其安装在氟装-G（Southern Biotech 0100-01）安装介质中。样品通过共焦显微镜（Olympus FV 1000）成像。

质谱法

对用于质谱分析的样品进行称重，并将其重新悬浮在50 mM碳酸氢铵溶液中。添加约5μl DTT（50 mM碳酸氢铵中5μg/μl），并在65°C下培养样品15分钟。培养后，添加5μl碘乙酰胺（15 mg/ml，在50 mM碳酸氢铵中），并将样品在室温下黑暗中保存30分钟。将在50 mM碳酸氢铵中制备的序列分级改良胰蛋白酶（Promega，Madison WI）以1:100的比例（酶：样品）在37°C下加入样品反应过夜。通过添加乙酸进行酸化来终止反应。样品在SpeedVac中干燥，并在0.1%甲酸中重新悬浮。在LC/MS/MS分析之前通过纳米液滴测量肽的浓度。

蛋白质鉴定的纳米液相色谱（LC）-纳米喷雾串联质谱（MS）（纳米LC/MS/MS）在配备有以正离子模式操作的纳米喷雾FAIMS Pro™源的Thermo Scientific orbittrap Fusion质谱仪上进行。使用Thermo Scientific的2D RSLC HPLC系统，在易喷雾纳米柱（Pepmap™RSLC，C18 3μm 100A，75μm×150 mm，Thermo科学）上分离样品（6.4μl）。将每个样品注入μ-预柱筒（Thermo Scientific）中，并用0.1%甲酸在水中脱盐5分钟。然后将注射器端口切换为注射，将肽从捕集器中洗脱到色谱柱上。流动相A为水中0.1%甲酸，乙腈（含0.1%甲酸）用作流动相B。流速设置为300 nl/min。流动相B在105分钟内从2%增加到16%，然后在10分钟内从16%增加到25%，再在1分钟内从25%增加到85%，然后再保持95%，然后在1分钟之内迅速恢复到2%。在下一次进样之前，在2%的流动相B（或98%A）下使柱平衡15分钟。

喷雾电压为1.95 kV，毛细管温度为305°C，获得MS/MS数据。质谱仪的扫描顺序基于预览模式数据相关的TopSpeed™方法：对在m/z 375和1500之间记录的全扫描进行分析编程，以及MS/MS扫描，以生成产物离子光谱，从而从未来3 s光谱中最丰富的峰开始，在连续扫描中确定氨基酸序列。为了实现高质量精度MS测定，在傅里叶变换（FT）模式下进行全扫描，并通过内部质量校准将分辨率设置为120 000。样品采集使用了三个补偿电压（cv=−50、−65和−80 V）。FT全扫描的自动增益控制（AGC）目标离子数设置为4×10⁵离子，最大离子注入时间设置为50ms，显微扫描次数设置为1。MSn是在离子阱模式下使用高能C阱离解（HCD）进行的，以确保MSn光谱的最高信号强度。HCD碰撞能量设定为32%。离子阱MSn扫描的AGC目标离子数设置为3.0×10⁴离子，最大离子注入时间设置为35ms，显微扫描次数设置为1。启用动态排除，60秒内重复计数为1，低质量宽度和高质量宽度为10 ppm。

使用MaxQuant处理原始MS数据[39]（2.0.3.0版），使用蛋氨酸氧化、脯氨酸氧化和N-末端乙酰化的可变修饰以及半胱氨酸的氨基甲酰化的固定修饰，对抗从Uniprot（2022年7月）获得的猪和牛蛋白质组。第一次搜索的前体容差设置为20 ppm，主搜索的前体制备容差为4.5 ppm，MS/MS容差设置在20 ppm。在肽谱匹配（PSM）和蛋白质水平方面，最多允许两次漏切，错误发现率设置为0.01。Ensemb生物集市[40,41]（Release 107）用于获得用于所有猪和牛蛋白质鉴定的人类直系同源物。然后利用矩阵体项目中的矩阵注释将匹配信息应用于映射的人类直系亲属[42].

基底膜分子渗透性

为了确定京尼平改性是否对TBM基质的孔结构有任何影响，在天然和京尼平修饰的膜中测量了Ficoll扩散渗透率。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Ficoll 70如前所述制备[43]. 将PBS中100μg/ml的Ficoll（0.5 ml）添加到心尖室，将PBS（1.5 ml）添加至基底室。在2小时和4小时对基本PBS进行取样。使用Ultrahydrogel 500色谱柱（Waters，Milford，MA）通过尺寸排除色谱法（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉）测定储备溶液和基础隔间中Ficoll浓度与分子半径的关系。流动相为PBS（150 mM NaCl，50 mM磷酸盐，200 ppm NaN_三pH 7.0），流速为0.5 ml/min，柱温为40°C。FITC-标记的Ficoll用荧光检测器（安捷伦科技G7121A）在495/520 nm的激发/发射下进行分析。分子渗透率如前所述测定[44].

肾小管上皮细胞的培养

如前所述培养条件永生化的小鼠肾近端小管上皮细胞[45]. 细胞在33°C下繁殖，并在使用前转移至37°C至少7天。细胞在含有2.5%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素、5μg/ml胰岛素、转铁蛋白和硒、6.5 ng/ml三碘甲状腺原氨酸、5×10⁻⁸M氢化可的松和92μg/ml D-缬氨酸。将干扰素-γ（10 ng/ml）添加到33°C的培养基中，而在37°C培养细胞时不添加。

细胞活力和增殖

为了确定脱细胞程序和/或京尼平处理是否导致任何显著的细胞死亡，使用活/死细胞活力测定（Invitrogen L3224）评估天然和京尼平修饰的TBM膜上的细胞活力。细胞培养在基底上汇合，并根据制造商建议的方案进行染色。通过标准表观荧光显微镜（Zeiss-Axioskop 2）上的成像评估活细胞和死细胞的相对比例。将数据归一化为对照组的平均值（未修改的Transwell膜）。

为了进行增殖分析，细胞在1×10⁴细胞/插入物并培养过夜。使用Click-iT EdU荧光分析试剂盒（分子探针C10637）根据EdU掺入量测量增殖。根据制造商建议的方案标记细胞，并将EdU掺入6 h。细胞用Hoechst 33342染色以量化细胞总数。样品安装在安装介质中，通过外荧光显微镜评估EdU阳性细胞核与总细胞的比率。将数据归一化为对照组（原生TBM）的平均值。

组织学和免疫荧光

为了评估细胞单层和TBM基质，细胞在1×10⁵细胞/插入物，并在天然和京尼平处理的底物上生长融合。样品在4%多聚甲醛中冰上固定20分钟，然后用PBS清洗。从支撑环上取下Transwell膜，并用剃须刀片切割成多个部分。样品嵌入Histogel（Fisher Scientific HG-4000-012）中，以帮助嵌入和切片。然后使用标准组织学技术进行石蜡包埋和切片。使用标准技术用H&E对细胞和基底膜基底进行染色，并通过光学显微镜对膜切片进行成像。使用ImageJ从H&E染色的横截面测量细胞高度。通过定量图像分析分析基底膜基质中的模式Wershof描述的基质生物信息学（TWOMBLI）工作流程等. [46]. 对于免疫荧光染色，固定后，细胞在室温下用0.1%Triton X-100（Ricca 8698.5-16）渗透15分钟。用PBS中的5%山羊血清（Southern Biotech 006001）封闭样品1小时。然后用1:200稀释的NCAD（细胞信号转导14215S）一级抗体在封闭缓冲液中检测细胞1小时。用PBS冲洗三次后，在黑暗中用1:200稀释的Alexa Fluor 647（Life Technologies A21235）荧光结合二级抗体在封闭缓冲液中培养细胞30分钟。用PBS清洗细胞三次。然后将细胞在1:200稀释的Alexa Fluor 488指骨肽（Life Technologies A12379）中黑暗培养30分钟。用PBS洗涤三次后，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（0.1μg/ml）反染细胞核10分钟。在用PBS清洗并从Transwell支撑环上取下膜后，将样品安装在荧光贴装G（SouthernBiotech）安装介质中。使用尼康A1R共焦显微镜拍摄图像。

PCR分析

对接种在天然和京尼平修饰TBM上的近曲小管细胞进行实时聚合酶链反应（RT-PCR），以评估硬度对促纤维化细胞因子结缔组织生长因子（CTGF）、两性调节蛋白（AREG）和转化生长因子β1（TGFB1）基因表达的影响以及肾小管上皮细胞分化标志物E-cadherin（ECAD）、NCAD和水通道蛋白1（AQP1）。培养48小时后，使用RNeasy微量试剂盒（Qiagen 74004）分离RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒（BioRad 1708891）合成cDNA。在CFX96 RT-PCR系统（BioRad）上使用iQ SYBR Green Supermix（BioRad）对合成的cDNA进行RT-PCR。将数据归一化为小鼠GAPDH水平作为内源性对照。使用ΔΔCt公式表达相对于对照组的表达水平，并使用CFX Maestro软件（BioRad）分析数据。

统计分析

灭菌前后的硬度数据(图2)使用配对分析t吨-测试。所有其他数据均通过普通方差分析（ANOVA）、未假设方差同质性时的Welch方差分析或Kruskal–Wallis非参数分析进行分析。分别使用事后Tukey、Dunnett或Dunn测试进行多重比较。数据在P（P） < 0.05. 使用GraphPad Prism分析数据。

结果

细胞培养基质是通过将脱细胞TBM压在可渗透细胞培养物上制成的。这在中进行了示意性描述图1a在SDS中对健康猪肾进行脱细胞处理。然后从去细胞肾基质中提取TBM，并使用压力将隔离的TBM紧贴在Transwell嵌件上。组织学显示，与天然肾脏相比，去细胞化充分去除了细胞成分，同时保留了ECM的整体结构(图1b). 在补充数据中可以找到天然和去细胞肾脏的其他组织学图像(图S1). TBM的纯化和压实导致形成相对平坦、均匀且没有任何明显缺陷的细胞培养基。共焦成像进一步分析(图1c)显示TBM培养基保留了层粘连蛋白和IV型胶原，这是基底膜的主要结构成分。IV型胶原和层粘连蛋白染色的俯视图如所示图1d补充数据中提供了免疫荧光染色的阴性（无主要）对照(补充图S2).

纯化TBM成分的质谱分析如所示图2.质谱能够量化46种不同的蛋白质亚型(表S1). 其中21个是Naba定义的核心基质蛋白等. [42]. 根据iBAQ强度，核心基质体占总肽量的68%。核心基质蛋白高度富集IV型胶原，TBM IV型胶原亚型（α1和α2）最丰富。根据iBAQ强度，纤维胶原蛋白（包括I、III和V型胶原蛋白）也检测到约20%的总量。此外还检测到其他基底膜蛋白，包括硫酸肝素蛋白多糖（HSPG2）、层粘连蛋白和基质细胞蛋白。

基质在PAA中灭菌。为了确定灭菌过程是否对ECM的机械性能有任何影响，在灭菌前后测量刚度。灭菌后硬度无明显变化(图3).

对天然和京尼平修饰的肾脏ECM进行应力松弛试验。典型的应力-时间曲线如所示图4a分析表明，天然和改性样品中的应力随着时间的推移而降低，并在2分钟的采集过程中以固定位移（0.4 mm）达到平衡。时间常数(表1)根据方程式计算1模型参数（E₁，E₂, η₁, η₂)也如所示表1.两个E₁，E₂和η₁, η₂随着京尼平浓度的增加而增加。该分析表明，京尼平处理对材料响应的弹性和粘性分量都有影响。Genipin修饰肾脏ECM导致基质硬度的剂量依赖性增加(图4b). 低浓度京尼平（0.05%）孵育导致基质硬度增加约4倍，而高浓度（0.5%）导致硬度增加6倍。硬度增加对应于基质对胃蛋白酶酶消化敏感性的显著降低(图4c). Genipin处理使胃蛋白酶消化率降低90-95%，表明交联增加。补充数据中提供了非正常胃蛋白酶溶解度数据(图S3).

确定TBM基板是否无缺陷，并确定所制膜是否保留了体内使用FITC-Ficoll评估基底膜的分子渗透性。这进一步允许确定京尼平修饰是否对TBM基底的孔结构有任何影响。尺寸依赖性分子通透性表明，天然和京尼平修饰的底物在分子半径>10nm处表现出尺寸依赖性的分子扩散限制和最小扩散传递(图5a). 特定分子半径（3、6和9 nm）的分析表明，京尼平处理倾向于降低扩散通透性，并且在0.5%京尼平的处理下，所有分析的分子半径都达到了统计显著性(图5b). 这表明交联可能通过在基膜中形成分子间或分子内交联对TBM的孔结构产生轻微但在统计上显著的影响。

为了确定TBM脱细胞过程和/或京尼平修饰是否导致细胞死亡，对未修饰和京尼平改性（0.5%）TBM相对于Transwell膜的细胞活力进行评估(图6a). 该分析表明，与在Transwell插入物上培养的细胞相比，天然TBM和京尼平修饰的TBM均支持细胞生长，而细胞活力无统计学显著降低。这表明脱细胞过程和京尼平的修饰都不会对细胞存活产生不利影响。为了进一步评估京尼平修饰对细胞功能的影响，对天然和京尼平改性的TBM进行了细胞增殖分析(图6b). 分析表明，京尼平修饰的TBM的增殖能力有轻微降低的趋势。这在0.05%京尼平组接近统计学意义(P（P） = 0.07），但两种京尼平处理浓度均未达到统计显著性。补充数据中提供了非正常增殖和生存能力数据(图S4).

为了评估肾小管上皮细胞在TBM底物上形成单层的能力，用H&E对培养底物进行染色。在天然和京尼平修饰的TBM上培养的细胞能够附着并形成融合的单层(图7). 用京尼平修饰的TBM膜在结构上与未修饰的TBMs相似。从H&E横截面测量的细胞高度表明，生长在0.5%京尼平改良底物上的上皮细胞的细胞厚度减少。天然和京尼平改性膜的TBM厚度分别为126±3、134±6和125±5μm（天然、0.05%和0.5%京尼平修改的TBM）。基于单因素方差分析，各处理之间的膜厚度在统计学上不显著。通过TWOMBLI对TBM基板进行定量分析，发现基质密度没有显著的统计变化。数据趋向于增加分支点和减少标准化终点，但差异没有达到统计显著性(补充图S5). 组织学处理过程中使用的多聚甲醛固定可能是该分析中的一个混淆因素。

为了进一步评估细胞形态并确定细胞是否在TBM基质上形成极化单层，用免疫荧光法对细胞进行F-actin和NCAD染色。所有底物上的管状上皮细胞在顶端细胞-细胞连接处都显示出显著的F-actin定位(图8). NCAD也高度定位于细胞-细胞连接处，表明细胞极化适当。

通过PCR分析与慢性肾脏疾病相关的已知促纤维化生长因子的基因表达，评估肾小管上皮对TBM硬度增加的反应。TGFB1基因表达不受TBM硬度增加的影响(图9a). 然而，CTGF和AREG基因表达均呈剂量依赖性显著上调。0.5%京尼平组CTGF和AREG基因表达增加达到统计学意义。我们还评估了上皮细胞分化表型ECAD、NCAD和AQP1的管状特异性标记的基因表达(图9b). 在天然和硬化TBM上评估基因表达水平。硬化基质诱导NCAD基因表达略有增加，但具有统计学意义。在京尼平修饰的TBM上未观察到ECAD或AQP1表达的变化。引物序列和产物大小见补充数据(表S2).

讨论

粘附细胞对ECM机制的变化非常敏感。ECM硬度的变化调节增殖、迁移、分化、细胞存活和许多其他细胞功能[47,48]. 病理组织力学已被证明可促进癌症转移、心血管功能障碍和纤维化[49–51]. 研究还表明，ECM机制在肾脏损伤中的变化。Alport综合征（IV型胶原的遗传缺陷）小鼠模型、人类免疫缺陷病毒相关肾病和药物性肾损伤模型的基质硬度降低[52,53]. 基质硬度增加被认为在肾纤维化中起作用[54].体外研究表明，肾小管上皮细胞对使用合成聚丙烯酰胺底物和基质时底物硬度的变化很敏感[25,27]. 这些研究已经开始阐明管状上皮细胞对基质硬度变化的反应机制。更好地概括体内肾脏疾病的微环境可能会进一步了解调节慢性肾脏疾病发生和发展的生物物理因素。

基底膜是内皮细胞、上皮细胞和肌肉细胞下面的ECM薄层。基底膜在支持这些细胞和定义特定组织隔室方面起着结构作用。基底膜还充当细胞信号平台，促进细胞内和细胞外间的内外信号传递[55]. 基底膜由IV型胶原和层粘连蛋白亚型的组织特异性网络以及许多结构和调节成分组成[30]. 即使在肾脏内，特定的组织腔室也有不同的基底膜成分。GBM由α345Ⅳ型胶原和层粘连蛋白521组成，而TBM主要是α112Ⅳ型胶原与层粘连素511[56].

本研究的目的是开发一种在体外利用直接从健康肾组织中提取的TBM建立基底膜硬化的实验模型，并利用该模型评估基底膜硬化对肾小管上皮细胞功能的影响。使用直接来源于感兴趣器官的基底膜准确地概括了体内微环境。脱细胞组织和器官被广泛用作器官替代的潜在支架[57,58]. 我们采用了一种常用于全器官脱细胞的基于洗涤剂（SDS）的脱细胞策略，然后使用压力将基底膜碎片压实成适合细胞培养的底物。该程序允许制造保留重要结构蛋白（包括IV型胶原和层粘连蛋白）的薄层TBM(图1c–d). 基于质谱的基质成分分析与之前脱细胞猪肾的分析类似[59,60]. IV型胶原（α112）是TBM特异的IV型胶原亚型，是检测到的最丰富的亚型。IV型胶原α4和α5也检测到较少程度。啮齿动物和奶牛的TBM中检测到IVα3–α5胶原[56]. 这可能是猪TBM的情况，也可能代表GBM的存在。纤维性胶原蛋白以及基底膜的其他成分，包括蛋白聚糖和糖蛋白也存在。该分析表明，TBM制剂富含ECM蛋白质，尤其是TBM胶原蛋白IV。

脱细胞器官采用了几种灭菌技术。这些技术包括伽玛射线照射、环氧乙烷和化学杀菌技术，无论是单独还是组合使用。这些方法对机械完整性和ECM架构有不同的影响[61–63]. 我们选择用PAA/乙醇进行化学杀菌。基于PAA的灭菌已被证明在多个组织系统中有效，我们的数据表明，这种灭菌方法导致ECM硬度略有下降，但在统计上没有显著性(图3). 灭菌也可能改变粘弹性反应。本研究未对此进行调查。

京尼平是一种来源于栀子果实的生物相容性交联剂[64,65]. 京尼平交联通常用于机械增强和降低组织工程结构的免疫原性[66–68]. 在这里，我们使用京尼平来控制TBM基底的硬度，并模拟基底膜的病理硬化。数据拟合到双组分麦克斯韦模型。单组分模型不能很好地拟合实验数据。时间常数（τ₁, τ₂)在天然样品和处理过的样品之间相对相似。京尼平治疗导致E和η的剂量依赖性增加，表明京尼平处理改变了反应的弹性和粘性成分。响应粘性分量的变化可能会改变细胞功能，而不受材料刚度变化的影响。当前模型中未考虑这些影响。京尼平诱导肾脏ECM平衡弹性模量的剂量依赖性增加(图4a). 这与ECM的胃蛋白酶溶解度显著降低同时发生(图4b)，ECM交联的替代措施[69]. 这些数据表明京尼平为控制组织衍生基底膜的力学性能提供了一种合适的手段。京尼平用作交联剂有一些固有的缺点。京尼平会导致基质变色和高背景荧光，这可能会干扰改性基质的成像。此外，天然和京尼平改性的TBM基质都不透明，因此无法像在培养皿或聚丙烯酰胺水凝胶上一样实时成像细胞。

我们使用FITC-Ficoll 70评估了天然和京尼平改性TBM的分子渗透性。这些研究用于确定底物是否无明显缺陷，脱细胞TBM是否保持分子尺寸选择性，并评估京尼平交联是否显著改变TBM的孔结构。数据表明，TBM基板具有尺寸选择性，随着分子半径的增加，分子渗透率降低(图5a). 分子渗透率特性与通过高分辨率电子显微镜测量的TBM孔结构一致[70]. 本研究发现，TBM的平均孔径为13 nm（6.5 nm半径），较大的孔隙主要分布在10–25 nm直径范围内。较小数量的大孔与我们观察到的分子渗透性很好地吻合，在10 nm半径（20 nm直径）处，分子传输减少但可测量。京尼平处理导致渗透率曲线出现微小的向下移动。这与京尼平处理后形成分子间或分子内交联导致平均孔径小幅度减小一致。京尼平交联壳聚糖支架也有类似的效果，京尼平处理后孔径减小，但壳聚糖支架的孔径明显增大[71]. Ficoll通透性降低在中间分子半径最为普遍，0.05和0.5%京尼平均导致Ficoll在6 nm处的通透性显著降低，具有统计学意义(图5b). 用0.5%京尼平治疗后，分析的所有分子半径（3、6和9 nm）的扩散通透性变化具有统计学意义。这些研究表明，基于观察到的分子尺寸选择性和扩散分子输运，TBM基板没有任何大缺陷，这与现有的TBM孔结构文献一致。任何通过肾小管上皮运输的溶质都必须通过TBM才能被重新吸收到循环中。京尼平处理略微减小了TBM的孔径。管状上皮细胞主要重新吸收水、葡萄糖和氨基酸等小分子。在京尼平修饰的TBM中，这些小溶质的扩散可能受孔径减小的影响最小。然而，大分子量溶质（蛋白质、生长因子和细胞因子）的运输可能会被疾病介导的交联所改变，并有必要进一步研究基底膜交联对高分子量溶质在基底膜中传输的影响。

京尼平修饰对细胞活力和增殖影响的结果好坏参半。几项研究表明，与非修饰组织支架相比，京尼平促进细胞粘附和增殖，对生存能力的影响最小，甚至是有益的[72,73]. 其他研究表明增殖减少，这可能是由于基质中未反应的京尼平残留所致[74]. 这与研究表明，在多种细胞类型中，游离的京尼平诱导细胞死亡并减少增殖是一致的[75]. 我们发现京尼平修饰并没有导致在修饰TBM上生长的肾小管上皮细胞发生任何显著的细胞死亡(图6a). Genipin修饰导致平均细胞增殖率略有降低，但没有达到统计学意义。基于先前研究表明刚性基质上的增殖增加，我们假设京尼平增强的TBM上的增殖会增加[76–78]. 在我们的研究中，情况并非如此，可能是因为硬度的相对细微变化，或刚性基质的竞争性促增殖作用和京尼平的抗增殖作用。

组织学染色显示，在天然和京尼平修饰的TBM上生长的细胞能够形成单层(图7). 细胞在TBM表面形成致密的单层。我们进一步通过NCAD免疫荧光染色和F-肌动蛋白阴茎倍体染色评估了细胞显示适当细胞极化的能力。顶端细胞-细胞连接处的F-肌动蛋白染色显示出密集的外周F-肌动蛋白带，与在其他肾小管上皮细胞中观察到的相似[79,80]. 这个F-actin带与NCAD非常接近，NCAD高度定位于顶端细胞-细胞连接处。在京尼平修饰的TBM中观察到一些潜在TBM的非特异性荧光，如0.05和0.5%京尼平NCAD染色所示图8这使得免疫荧光的任何潜在定量变得复杂，但仍然可以可视化在天然和京尼平修饰的TBM上培养的上皮细胞的极化和蛋白质定位。

肾上皮损伤的标志是多种促纤维化细胞因子和生长因子的产生增加，这些因子通过自分泌或旁分泌信号传导导致肾损伤[81]导致多种原发性过程，包括细胞脱分化、ECM蛋白的过度生产以及细胞增殖和存活的改变。TGF-β是一种公认的慢性肾脏疾病中肾小管间质损伤的最重要因素[82]. CTGF和AREG也与肾脏慢性肾损伤有关。研究表明，CTGF可以促进细胞脱分化，并诱导ECM成分（包括IV型胶原和I型胶原）的过度生成[83]. AREG已被证明通过与EGFR信号的相互作用促进肾纤维化[84]. 我们没有观察到京尼平修饰对TGFB1基因表达的直接影响(图9a). 这与先前的研究一致，研究表明TGFB1基因在原代肾小管上皮细胞中的表达没有改变，而是TGFB1受体表达增加[27]. 我们确实观察到在强化TBM培养的细胞中直接诱导CTGF和AREG基因表达增加。有趣的是，CTGF与AREG都是YAP/TAZ激活的下游靶点。生物物理刺激，包括增加基质硬度，可诱导YAP和TAZ核移位，其中YAP和TAZ核移位具有转录活性，并驱动多个靶基因的基因表达增加[85]. 肾小管上皮细胞中CTGF和AREG的上调与在京尼平修饰的TBM上生长的肾小管内皮细胞中YAP/TAZ的机械激活相一致。我们还测量了调节屏障功能和水转运的肾小管上皮特异性标记物的基因表达。钙粘蛋白通过定位于细胞-细胞连接处来调节上皮屏障功能，而NCAD是近端小管中表达的主要钙粘蛋白[86]. AQP1参与近端肾小管的水再吸收。京尼平修饰的TBM上调NCAD基因表达(图9b). 先前的研究表明，基质硬度增加了血管平滑肌和肝癌细胞中NCAD的表达[76,87]. 在这里，我们观察到肾小管上皮细胞中NCAD基因表达增加。总的来说，这些数据表明TBM硬化增加了潜在纤维化生长因子的基因表达，并可能调节细胞-细胞连接组织。

结论

我们开发了一种体外用细胞培养模型研究肾近端小管上皮细胞的细胞-膜相互作用。该实验系统利用从健康肾组织中提取的基底膜，概括出肾组织的复杂组成和力学机制体内微环境。通过化学交联改变基底膜的力学性能，以研究肾小管上皮细胞对基质刚度增加的反应。TBM基底的特征表明形成了无缺陷表面，保留了体内基底膜。交联诱导了TBM分子通透性的轻微但可测量的变化。底物支持在天然和硬化TBM上形成极化上皮细胞单层。TBM僵硬度增加导致与慢性肾损伤相关的既定促纤维化细胞因子的基因表达改变，以及上皮特异性分化标记物的表达改变。该系统可以作为一个平台，进一步研究基底膜力学在模拟疾病组织微环境的条件下促进肾上皮细胞损伤的作用。

致谢

我们感谢来自校园显微镜和成像设施以及俄亥俄州立大学综合癌症中心显微镜共享资源的资源。我们要感谢Roy Zent博士和Betha Elias博士（范德比尔特大学医学中心）提供了本研究中使用的近端小管细胞。

数据可用性声明

本文所包含的数据将根据相应作者的合理要求进行共享。

基金

美国国家科学基金会职业奖（授予编号：1944386，授予N.F.）、美国肾脏病学会卡尔·W·哥特斯克尔奖（授予N.F..）和美国肾脏病协会本·J·利普斯研究奖学金（授予D.W.）。

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