抗原检索协议

·了解抗原检索的两种方法:热介导法(也称为热诱导表位检索或HIER)酶法。

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大多数福尔马林固定组织在免疫组织化学染色之前需要抗原检索步骤。亚甲基桥形成固定交联蛋白和面膜抗原位点。抗原检索方法打破这些亚甲基桥和暴露抗原位点,使抗体结合。抗原提取的两种方法是热诱导表位检索(HIER)和酶促检索。

酶促提取有时会损伤切片的形态,因此需要对其浓度和处理时间进行测试。

热诱导表位检索最常用的是使用压力锅、微波炉或蔬菜蒸笼。一些实验室使用水浴设置为60°C,并在检索溶液中一夜之间将幻灯片孵育。这是有用的,当工作组织切片脱落在高温下加热时,特别是骨,软骨和皮肤。

除非抗原检索方法被描述在抗体数据表上,每种抗原的最佳方法必须在实验中找到。这也适用于用于热介导的检索的缓冲器的选择。我们建议测试几种方法来找到最佳染色的检索方法。

结果可靠的缓冲区

对于热介导的抗原检索的稳健结果,我们推荐我们预先配制的抗原检索缓冲液。这些包括三个最常用的缓冲区-从我们的选择柠檬酸缓冲液试剂盒三乙基乙二胺四乙酸缓冲液试剂盒EDTA缓冲试剂盒或使用我们的TIS缓冲试剂盒.

我们也提供通用热媒介抗原回收试剂盒(与我们领先的PD-L1克隆23-8一起使用)与大多数抗体相容,并且消除了对多个缓冲剂的需要。

对于酶抗原检索,我们建议我们胰蛋白酶试剂盒. 我们也提供胃蛋白酶溶液试剂盒蛋白酶K试剂盒.

或者,您可以准备自己的缓冲区和解决方案,并使用下面相同的推荐方法。



热诱导表位检索的缓冲溶液

下面的解决方案是三种更流行的HIER缓冲器。在没有数据表信息的情况下,检索缓冲区的选择最好通过试验来完成。

柠檬酸钠缓冲液(柠檬酸钠10 mM,吐温20,pH 6)

  • 柠檬酸三钠(二水合物)2.94克
  • 蒸馏水1 L
  • 混合溶解。用1N HCl将pH调节至6。
  • 加入0.5毫升吐温20,拌匀。室温保存3个月或以上
  • 4°C长时间储存

1毫米乙二胺四乙酸,pH 8

  • 乙二胺四乙酸0.37克
  • 蒸馏水1 L
  • 用NaOH调节pH值8
  • 常温贮藏3个月

TrIS-EDTA缓冲液(10 mM TrIS碱,1毫米EDTA溶液,0.05%吐温20,pH 9)

  • TrIS 1.21 G
  • 乙二胺四乙酸0.37克
  • 蒸馏水1 L
  • 混合溶解。调整pH值至9。
  • 加入0.5毫升吐温20并拌匀。在室温下储存3个月或4℃储存更长时间。


热诱导表位检索方法:压力锅

幻灯片应该放在金属支架上。

材料和试剂

  • 国产不锈钢压力锅
  • 热板
  • 带有滑动架的容器保持大约400~500毫升
  • 抗原检索缓冲液(TrIS/EDTA pH 9,柠檬酸钠pH 6,或其它)


方法

建议控制实验以优化检索时间,其中在免疫组织化学染色之前检索相同组织切片的幻灯片1, 2, 3、4和5分钟。

  1. 向压力锅中加入适当的抗原回收缓冲液。将压力锅放在热盘上,并将其完全打开。不要在这个时候固定压力锅的盖子,简单地把它放在上面。在等待压力锅沸腾时,脱石蜡并重新加水。
  2. 一旦煮沸,将玻片从自来水转移到压力锅。

    使用热溶液护理-使用镊子。
  3. 按制造商的指示固定压力锅盖。
  4. 一旦灶具达到完全压力,时间为3分钟。
  5. 3分钟后,关掉热板,把压力锅放在一个空水槽里。
  6. 启动压力释放阀并在灶具上运行冷水。一旦减压,打开盖子并将冷水放入锅中10分钟。

    这是为了允许幻灯片足够冷,以便它们可以被处理,并且允许抗原位点在暴露于高温之后重新形成。

    小心处理热解决方案。
  7. 继续免疫组织化学染色。
    ·


热诱导表位检索方法:微波

家用微波炉的使用是不可取的。热点和冷点是常见的,导致不均一的抗原检索。抗原恢复时间通常较长,因为没有加压环境,几乎总是导致部分解离。科学的微波更合适。大多数品牌都有船上的压力容器,并可以保持温度恒定在98°C,以避免部分解离。

当使用该方法时,缓冲液沸腾是可能的,并且大量的检索缓冲器会蒸发。一定要注意滑动容器的缓冲液位,必要时再加上缓冲液。不要让幻灯片变干。

幻灯片应放置在塑料齿条和容器中。标准玻璃组织学染色架和容器在加热时会开裂。

材料和试剂

  • 科学微波或家用(850 W)
  • 带有滑动架的可微波容器,保持约400~500毫升或钴瓶
  • 抗原回收缓冲液(如TrIS/EDTA pH 9,柠檬酸钠pH 6等)

方法

  1. 分离和复水切片。

    使用足够量的抗原检索溶液覆盖幻灯片至少几厘米。
  2. 将合适的抗原回收缓冲液添加到可微波的容器中。

    使用非密封容器以允许在沸腾过程中蒸发。一定要监测蒸发量,注意在操作过程中煮沸,不要让滑块干燥。
  3. 将幻灯片放在可微波炉中。将容器放入微波炉内。如果使用家用微波炉,设置满功率并等待溶液沸腾。从这个点煮沸20分钟。如果使用科学微波程序,一旦温度达到98°C,抗原被回收20分钟。

    使用非密封容器以允许在沸腾过程中蒸发。一定要监测蒸发量,注意在操作过程中煮沸,不要让滑块干燥。
  4. 20分钟后,取出容器,将冷自来水注入10分钟,用热溶液护理。

    这允许幻灯片冷却足够,以便它们可以被处理,并且允许抗原位点在暴露于高温之后重新形成。
  5. 继续免疫组织化学染色。



热诱导表位检索方法:蔬菜蒸笼

许多实验室使用蔬菜蒸煮器或电饭煲进行热介导的抗原检索。该过程类似于微波,它保持缓冲液的温度在100℃,但没有微波法的剧烈沸腾。该方法可适用于在100°C代替水轮的水浴装置。

幻灯片应放置在塑料或金属齿条和容器中。标准玻璃组织学染色架和容器在加热时会开裂。

材料和试剂

  • 蔬菜蒸笼
  • 带有滑动架的容器保持约400~500毫升(或如果使用组织TEK容器250毫升)
  • 抗原回收缓冲液(如TrIS/EDTA pH 9,柠檬酸钠pH 6)

    ·

方法

  1. 将上述部分去污和复水。
  2. 根据厂家的指示和预热设置蔬菜蒸笼。

    使用非密封容器以允许在沸腾过程中蒸发。一定要监测蒸发量,注意在操作过程中煮沸,不要让滑块干燥。
  3. 将适当的抗原回收缓冲液预热到烧瓶中煮沸。
  4. 把装有滑架的容器放进蔬菜蒸笼里。
  5. 小心地将热缓冲区添加到容器中,接着是滑动架。如果更方便,在将容器放入蒸笼之前,将缓冲液添加到容器中。
  6. 关上轮船的盖子。缓冲器的容器也应该有盖子。载玻片最初会使抗原回收液的温度下降,但在几分钟内它会恢复到95到100°C。
  7. 把容器放在蒸笼里20分钟。
  8. 20分钟后,取出容器,将冷自来水注入10分钟,用热溶液护理。

    使用非密封容器以允许在沸腾过程中蒸发。一定要监测蒸发量,注意在操作过程中煮沸,不要让滑块干燥。
  9. 继续免疫组织化学染色。



酶抗原检索

使用的酶将在抗体数据表上显示。如果不是,胰蛋白酶可用于广泛的抗原,需要检索福尔马林/PFA固定。

至少有两种方法将酶溶液施加到组织上:直接将溶液移到载玻片上的组织上,或者将一组组织切片放入酶溶液容器中。第一种方法使用较少的试剂,但由于每个幻灯片需要单独处理,所以需要仔细监测每个幻灯片的孵育时间,以确保所有的幻灯片都接受相同的处理。因此,将大批量的幻灯片浸入酶溶液容器中更容易处理。如果使用自动染色系统(如VunANA),请咨询制造商以获得合适的酶回收方案。

吸液法:材料和试剂

  • 37°C培养箱
  • 加湿室(无论是培养箱本身还是湿纸巾容器)
  • 具有滑动架的TBS的两个滑架容器
  • 酶促抗原回收液(胰蛋白酶,见下文)

胰蛋白酶原液(蒸馏水中的0.5%)

  • 胰蛋白酶50毫克
  • 蒸馏水10毫升
  • 混合溶解,储存在-20℃

氯化钙原液(1%)

  • 氯化钙0.1克
  • 蒸馏水10毫升
  • 拌匀储存4℃

胰蛋白酶工作液(0.05%)

  • 胰蛋白酶原液(0.5%)1毫升
  • 氯化钙原液1%毫升1毫升
  • 蒸馏水8毫升
  • 用1N NaOH将pH调节到7.8。储存在4℃下一个月或20℃长期贮存


移液法

  1. 制备胰蛋白酶溶液并预热至37°C。小心地将组织切片周围多余的水污渍,并将酶溶液(一般为50~100μL)移到切片上。可能需要用吸管尖端将溶液分散在切片周围,注意不要损伤组织。
  2. 将幻灯片放入加湿容器中,然后放入37°C培养箱中。避免将载玻片直接放在培养箱的架子上,因为温度会影响染色强度。理想地,保持载玻片的容器在孵化器中预热。
  3. 10至20分钟后(这将需要优化),从孵化器中移出幻灯片,并将其转移到自来水容器中的架子上。用自来水冲洗3分钟。
  4. 继续免疫组织化学染色。


浸渍法:材料和试剂

  • 37°C水浴
  • 滑动架和滑动架集装箱
  • 酶促抗原回收液(用于胰蛋白酶,见酶促移液法)


浸渍法:浸渍法

一定要阅读你选择的酶的制造商的文献,因为一些酶需要特定的缓冲液和活性辅因子。

  1. 将水浴设定为所使用的酶的最佳温度。将超纯水加到两个可以容纳滑架的容器中。将容器放入水浴中加热。

    使用足够量的水或缓冲器来覆盖滑块。
  2. 分离和复水段如上。将幻灯片放在一个水容器中取暖。

    将冷滑片放入酶溶液中会降低溶液的温度,降低酶活性并导致抗原位点的检索不足。
  3. 从另一个容器中的温水中制备酶促抗原回收缓冲液,然后将容器返回到水浴中,以使溶液重新加热。

    尽可能快地制备酶促抗原回收液,以避免酶活性受损。在引入幻灯片之前,允许该溶液返回温度。
  4. 将温热的幻灯片转移到酶溶液中10至20分钟,然后用间歇的温和搅拌,然后将幻灯片移开,放入自来水中冲洗3分钟。

    检索时间应通过在酶溶液中孵育10, 15, 20、25和30分钟的组织切片来优化。I免疫组织化学染色。
  5. 继续免疫组织化学染色。



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