IHC抗原检索协议

​了解抗原检索的两种方法：热介导（也称为热诱导表位检索或HIER)和酶。

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大多数福尔马林固定组织在免疫组织化学染色前需要抗原回收步骤。亚甲基桥在固定过程中形成交联蛋白并掩盖抗原位点。抗原提取方法打破这些亚甲基桥，暴露抗原位点，使抗体结合。抗原检索的两种方法是热诱导表位检索（HIER）和酶检索。

酶回收有时会破坏切片的形态，因此需要测试浓度和处理时间。

热诱导表位检索通常使用压力锅、微波炉或蔬菜蒸锅进行。一些实验室使用设置为60°C的水浴，并在回收溶液中培养载玻片过夜。当组织切片在较高温度下加热时从载玻片上脱落时，这很有用；尤其是骨骼、软骨和皮肤。

除非抗体数据表中规定了抗原回收方法，否则必须通过实验找到每种抗原的最佳方法。这也适用于选择用于热介导检索的缓冲区。我们建议测试几种方法，以找到最佳染色的检索方法。

方便的缓冲区，带来可靠的结果

为了获得热介导抗原检索的稳健结果，我们推荐我们预先制定的抗原检索缓冲液。其中包括三种最常用的缓冲区-从我们的柠檬酸缓冲液套件,Tris-EDTA缓冲套件，或EDTA缓冲套件; 或使用我们的Tris缓冲套件.

我们还提供通用热介导抗原回收试剂盒（与我们领先的PD-L1克隆28-8一起使用），与大多数抗体兼容，不需要多个缓冲液。

对于酶抗原检索，我们建议胰蛋白酶溶液试剂盒。我们还提供胃蛋白酶溶液试剂盒和蛋白酶K溶液试剂盒.

或者，您可以准备自己的缓冲液和解决方案，并使用下面推荐的相同方法。

​热诱导表位检索的缓冲溶液

以下解决方案是HIER中比较流行的三种缓冲区。在缺乏数据表信息的情况下，最好通过试验来选择检索缓冲区。

柠檬酸钠缓冲液（10 mM柠檬酸钠，0.05%吐温20，pH 6.0）

• 柠檬酸三钠（二水合物）2.94克
• 蒸馏水1 L
• 混合溶解。用1N HCl调节pH至6.0。
• 加入0.5毫升吐温20并充分混合。在室温下储存3个月或
• 4°C，储存时间更长
  
  

1 mM EDTA，pH 8.0

• 乙二胺四乙酸0.37克
• 蒸馏水1 L
• 用NaOH调节至pH 8.0
• 在室温下储存3个月
  
  

Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris碱，1 mM EDTA溶液，0.05%吐温20，pH 9.0）

• Tris 1.21克
• 乙二胺四乙酸0.37克
• 蒸馏水1 L
• 混合溶解。将pH值调节至9.0。
• 添加0.5 mL吐温20并充分混合。在室温下储存3个月或在4°C下储存更长时间。

热诱导表位检索方法：压力锅

此过程中，应将滑块放在金属架上。

材料和试剂

• 家用不锈钢压力锅
• 加热板
• 带有滑架的容器，可容纳约400–500 mL
• 抗原回收缓冲液（Tris/EDTA pH 9.0，柠檬酸钠pH 6.0或其他）

方法

建议进行对照实验，以优化取回时间，取同一组织切片的载玻片1、2、3、4和5分钟，然后进行免疫组织化学染色。

1. 将适当的抗原回收缓冲液添加到压力锅中。把压力锅放在电炉上，然后把它打开。此时不要固定压力锅的盖子，只需将其放在上面即可。在等待高压锅沸腾的同时，对部分进行脱油和再水化。
2. 煮沸后，将载玻片从自来水中转移到高压锅中。
   
   小心使用热溶液–使用镊子。
3. 按照制造商的说明固定高压锅盖。
4. 一旦炊具达到全压，时间为3分钟。
5. 3分钟后，关闭加热板，将压力锅放在空水槽中。
6. 启动压力释放阀，将冷水浇到炊具上。减压后，打开盖子，向炊具内注入冷水10分钟。
   
   这是为了使载玻片足够冷却，从而可以处理它们，并使抗原位点在暴露于高温后重新形成。
   
   小心处理热溶液。
7. 继续免疫组织化学染色方案。
   ​

热诱导表位检索方法：微波

不宜使用家用微波炉。热点和冷点很常见，导致抗原检索不均衡。由于缺乏加压环境，抗原提取时间通常较长，几乎总是导致切片分离。科学微波炉更合适。大多数品牌的船上都有压力容器，可以将温度保持在恒定的98°C，以避免分段分离。

使用此方法时，缓冲液可能会沸腾，大量检索缓冲液将蒸发。确保观察滑动容器的缓冲水平，必要时添加更多缓冲。不要让幻灯片变干。

本程序中，应将滑块放在塑料架和容器中。标准玻璃组织学染色架和血管在加热时会破裂。

​材料和试剂

• 科学微波炉或家用（850 W）
• 带有滑架的微波容器，可容纳约400–500 mL或科普林斯罐
• 抗原回收缓冲液（例如Tris/EDTA pH 9.0、柠檬酸钠pH 6.0等）
  
  

方法

1. 脱蜡并重新脱水。
   
   使用足够体积的抗原回收溶液将载玻片覆盖至少几厘米。
2. 将适当的抗原回收缓冲液添加到微波血管中。
   
   使用非密封容器，以便在沸腾过程中蒸发。确保监测蒸发情况，并在操作过程中注意沸腾，不要让载玻片变干。
3. 将载玻片放入微波容器中。将容器置于微波炉内。如果使用家用微波炉，请设置为满功率，等待溶液沸腾。从这一点开始煮20分钟。如果使用科学微波炉,程序，以便在温度达到98°C时检索抗原20分钟。
   
   使用非密封容器，以便在沸腾过程中蒸发。在操作过程中，一定要监测蒸发情况，注意是否沸腾，不要让幻灯片变干。
4. 20分钟后，取出容器，将冷自来水倒入其中10分钟。小心使用热溶液。
   
   这使得载玻片足够冷却，以便可以进行处理，并允许抗原位点在暴露于高温后重新形成。
5. 继续免疫组织化学染色方案。
   
   

​热诱导表位检索方法：蔬菜蒸笼

许多实验室使用蔬菜蒸锅或电饭煲进行热介导抗原检索。该程序与微波相似，因为它将缓冲液的温度保持在100°C，但没有微波法的剧烈沸腾。此方法可适用于设置在100°C的水浴，以代替蒸锅。

本程序中，应将滑块放置在塑料或金属架和容器中。标准玻璃组织学染色架和容器在加热时会破裂。

材料和试剂

• 蔬菜蒸笼
• 带有滑架的容器，可容纳约400–500 mL（如果使用Tissue-Tek容器，则为250 mL）
• 抗原回收缓冲液（例如Tris/EDTA pH 9.0，柠檬酸钠pH 6.0）
  
  ​

方法

1. 如上所述，对各部分进行除石蜡和再水化处理。
2. 按照制造商的说明设置蔬菜蒸笼并预热。
   
   使用非密封容器，以便在沸腾过程中蒸发。确保监测蒸发情况，并在操作过程中注意沸腾，不要让载玻片变干。
3. 将适当的抗原回收缓冲液在烧瓶中预热至沸腾。
4. 把盛载滑梯架的容器放入蔬菜蒸笼。
5. 小心地将热缓冲液添加到容器中，然后添加滑架。如果方便的话，在将容器放入蒸笼之前，将缓冲液添加到容器中。
6. 盖上蒸笼的盖子。缓冲液容器也应有盖子。载玻片架最初会降低抗原回收溶液的温度，但几分钟内就会恢复到95–100°C。
7. 从这一点开始，将容器放在蒸笼中20分钟。
8. 20分钟后，取出容器，将冷自来水倒入其中10分钟。小心使用热溶液。
   
   使用非密封容器，以便在沸腾过程中蒸发。确保监测蒸发情况，并在操作过程中注意沸腾，不要让载玻片变干。
9. 继续免疫组织化学染色方案。
   
   

​酶抗原检索

使用的酶将在抗体数据表上注明。如果没有，胰蛋白酶对需要回收福尔马林/PFA后固定的广泛抗原有用。

将酶溶液应用于组织至少有两种方法：直接用吸液管将溶液移到载玻片上的组织上，或将组织载玻片架放入酶溶液容器中。第一种方法使用较少的试剂，但由于每个载玻片都需要单独处理，因此需要仔细监测每个载玻片的培养时间，以确保所有载玻片均接受相同的处理。因此，将大批量的载玻片浸泡在酶溶液容器中更容易处理。如果使用自动染色系统（如Ventana），请咨询制造商以获取适当的酶回收协议。

移液方法：材料和试剂

• 37°C培养箱
• 加湿室（培养箱本身或装有湿纸巾的容器）
• 两个带滑架的TBS滑架集装箱
• 酶抗原回收液（胰蛋白酶，见下文）
  
  

胰蛋白酶原液（蒸馏水中0.5%）

• 胰蛋白酶50毫克
• 蒸馏水10 mL
• 混合溶解，储存于-20ºC
  
  

氯化钙储备液（1%）

• 氯化钙0.1克
• 蒸馏水10 mL
• 搅拌均匀并储存在4ºC下
  
  

胰蛋白酶工作液（0.05%）

• 胰蛋白酶原液（0.5%）1 mL
• 氯化钙储备液1%1 mL
• 蒸馏水8 mL
• 用1N NaOH将pH调节至7.8。在4ºC下储存一个月或-20ºC长期储存
  
  

移液方法：方法

1. 制备胰蛋白酶溶液并预热至37°C。小心地吸干组织切片周围多余的水，用吸管将酶溶液（通常50–100μL即可）移到切片上。可能需要用吸液管尖端将溶液分散在截面周围；小心不要损坏组织。
2. 将载玻片放入加湿容器中，然后放入37°C培养箱。避免将载玻片直接放在培养箱架子上，因为温度会有变化，这可能会影响染色强度。理想情况下，盛载载玻片的容器在培养箱中预先加热。
3. 10–20分钟后（这需要优化），将载玻片从培养箱中取出，并转移到装有自来水的容器中的支架上。用自来水冲洗3分钟。
4. 继续免疫组织化学染色方案。
   
   
   

浸渍法：材料和试剂

• 37°C水浴
• 滑架和滑架容器
• 酶抗原回收液（胰蛋白酶见酶回收移液法）

浸泡法：方法

请务必阅读制造商提供的有关所选酶的文献，因为有些酶需要特定的缓冲液和辅因子才能发挥活性。

1. 将水浴温度设置为所用酶的最佳温度。将超纯水添加到两个可容纳滑架的容器中。将容器放入水浴中加热。
   
   用足够的水或缓冲液盖住幻灯片。
2. 如上所述对各部分进行除石蜡和再水化。将幻灯片放在一个水容器中加热。
   
   将冷载玻片放入酶溶液中会降低溶液的温度，降低酶的活性，导致抗原位点的回收不足。
3. 从另一个容器中的温水中制备酶抗原回收缓冲液，然后将容器返回水浴，使溶液重新加热。
   
   尽快制备酶抗原回收溶液，以避免损害酶的活性。在引入载玻片之前，让溶液恢复到温度。
4. 将加热后的载玻片转移到酶溶液中10–20分钟，并间歇轻轻搅拌，然后取出载玻片并将其放在流动自来水中3分钟，以冲洗掉酶。
   
   应通过在酶溶液中培养组织切片10、15、20、25和30分钟来优化检索时间我免疫组织化学染色。
5. 继续进行免疫组织化学染色方案。
   
   

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