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IHC抗原检索协议

了解抗原检索的两种方法:热介导(也称为热诱导表位检索或HIER)和酶法。
上次编辑时间2023年1月31日星期二

大多数福尔马林固定组织在免疫组织化学染色前需要抗原回收步骤。亚甲基桥在固定过程中形成交联蛋白并掩盖抗原位点。抗原检索方法打破这些亚甲基桥并暴露抗原位点,使抗体结合。抗原检索的两种方法是热诱导表位检索(HIER)和酶检索。

除非抗体数据表中规定了抗原检索方法,否则必须通过实验找到每个抗原的最佳方法。这也适用于选择用于热介导检索的缓冲区。我们建议测试几种方法,以找到最佳染色的检索方法。

阶段1-热诱导表位检索(HIER)

热诱导表位检索通常使用压力锅、微波炉或蔬菜蒸锅进行。一些实验室使用设置为60°C的水浴,并在回收溶液中培养载玻片过夜。这在处理在高温下加热时从玻片上脱落的组织切片时很有用,尤其是骨骼、软骨和皮肤。

此过程中,应将滑块放在金属架上。

建议进行对照实验,以优化取回时间,取同一组织切片的载玻片1、2、3、4和5分钟,然后进行免疫组织化学染色。

所需材料

材料和试剂

  • 家用不锈钢压力锅
  • 加热板
  • 带有滑架的容器,可容纳约400–500 mL
  • 抗原提取缓冲液(Tris/EDTA公司pH 9.0,柠檬酸钠pH 6.0或其他)

步骤

1

将适当的抗原回收缓冲液添加到压力锅中。

  • 把压力锅放在电炉上,然后把它打开。
  • 在等待高压锅沸腾的同时,对部分进行脱油和再水化。
2

煮沸后,将载玻片从自来水中转移到高压锅中。

按照制造商的说明固定高压锅盖。

4

一旦炊具达到全压,时间为3分钟。

5

3分钟后,关闭加热板,将高压锅放在空水槽中。

6

启动压力释放阀,将冷水浇到炊具上。

  • 减压后,打开盖子,向炊具内注入冷水10分钟。
7

继续免疫组织化学染色方案。

第2阶段-酶抗原检索

酶回收有时会破坏切片的形态,因此需要测试浓度和处理时间。将酶溶液应用于组织至少有两种方法:直接用吸液管将溶液移到载玻片上的组织上,或将组织载玻片架放入酶溶液容器中。第一种方法使用较少的试剂,但由于每个载玻片都需要单独处理,因此必须仔细监测培养时间,以确保所有载玻片均接受相同的处理。因此,将大批量的载玻片浸泡在酶溶液容器中更容易处理。如果使用自动染色系统(如Ventana),请咨询制造商以获取适当的酶回收协议。

使用的酶将在抗体数据表上注明。如果不是,胰蛋白酶可用于福尔马林/PFA固定后需要回收的广泛抗原。

将酶溶液应用于组织至少有两种方法:直接用吸液管将溶液移到载玻片上的组织上,或将组织载玻片架放入酶溶液容器中。第一种方法使用较少的试剂,但由于每个载玻片都需要单独处理,因此必须仔细监测培养时间,以确保所有载玻片均接受相同的处理。因此,将大批量的载玻片浸泡在酶溶液容器中更容易处理。如果使用自动染色系统(如Ventana),请咨询制造商以获得合适的酶检索方案。

请务必阅读制造商提供的有关所选酶的文献,因为有些酶需要特定的缓冲液和辅因子才能发挥活性。

所需材料

移液方法:材料和试剂

  • 37°C培养箱
  • 加湿室(培养箱本身或带有湿纸巾的容器)
  • 两个带滑架的TBS滑架集装箱
  • 酶抗原回收液(胰蛋白酶,见下文)

对于酶抗原检索,我们建议胰蛋白酶解决方案套件。我们还提供胃蛋白酶溶液试剂盒和蛋白酶K溶液试剂盒。

或者,您可以准备自己的缓冲液和解决方案,并使用下面推荐的相同方法。

胰蛋白酶原液(蒸馏水中0.5%)

  • 胰蛋白酶50毫克
  • 蒸馏水10 mL
  • 混合溶解,储存于-20ºC

氯化钙储备液(1%)

  • 氯化钙0.1克
  • 蒸馏水10 mL
  • 充分混合并在4ºC下储存

胰蛋白酶工作液(0.05%)

  • 胰蛋白酶原液(0.5%)1 mL
  • 氯化钙储备液1%1 mL
  • 蒸馏水8 mL
  • 用1N NaOH将pH调节至7.8。在4ºC下储存一个月或-20ºC长期储存

步骤

1

将水浴温度设置为所用酶的最佳温度。

  • 向两个可放置滑架的容器中添加超纯水
  • 将容器放入水浴中加热。
2

脱蜡和再水化部分。

  • 将幻灯片放在一个水容器中加热。


从另一个容器中的温水中制备酶抗原回收缓冲液。

  • 然后,将容器放回水浴中,使溶液重新加热。
4

将加热后的载玻片转移到酶溶液中10–20分钟,并间歇轻轻搅拌。

  • 在此之后,取出载玻片并将其放在流动的自来水中3分钟,以冲洗掉酶。
5

继续免疫组织化学染色方案。