热诱导表位检索的缓冲溶液
下面的解决方案是三种更流行的HIER缓冲器。在没有数据表信息的情况下，检索缓冲区的选择最好通过试验来完成。
柠檬酸钠缓冲液（柠檬酸钠10 mM，吐温20，pH 6）
- 柠檬酸三钠（二水合物）2.94克
- 蒸馏水1 L
- 混合溶解。用1N HCl将pH调节至6。
- 加入0.5毫升吐温20，拌匀。室温保存3个月或以上
- 4°C长时间储存
1毫米乙二胺四乙酸，pH 8
- 乙二胺四乙酸0.37克
- 蒸馏水1 L
- 用NaOH调节pH值8
- 常温贮藏3个月
TrIS-EDTA缓冲液（10 mM TrIS碱，1毫米EDTA溶液，0.05%吐温20，pH 9）
- TrIS 1.21 G
- 乙二胺四乙酸0.37克
- 蒸馏水1 L
- 混合溶解。调整pH值至9。
- 加入0.5毫升吐温20并拌匀。在室温下储存3个月或4℃储存更长时间。
热诱导表位检索方法：压力锅
幻灯片应该放在金属支架上。
材料和试剂
- 国产不锈钢压力锅
- 热板
- 带有滑动架的容器保持大约400～500毫升
- 抗原检索缓冲液（TrIS/EDTA pH 9，柠檬酸钠pH 6，或其它）
方法
建议控制实验以优化检索时间，其中在免疫组织化学染色之前检索相同组织切片的幻灯片1, 2, 3、4和5分钟。
- 向压力锅中加入适当的抗原回收缓冲液。将压力锅放在热盘上，并将其完全打开。不要在这个时候固定压力锅的盖子，简单地把它放在上面。在等待压力锅沸腾时，脱石蜡并重新加水。
- 一旦煮沸，将玻片从自来水转移到压力锅。
使用热溶液护理-使用镊子。 - 按制造商的指示固定压力锅盖。
- 一旦灶具达到完全压力，时间为3分钟。
- 3分钟后，关掉热板，把压力锅放在一个空水槽里。
- 启动压力释放阀并在灶具上运行冷水。一旦减压，打开盖子并将冷水放入锅中10分钟。
这是为了允许幻灯片足够冷，以便它们可以被处理，并且允许抗原位点在暴露于高温之后重新形成。
小心处理热解决方案。 - 继续免疫组织化学染色。
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热诱导表位检索方法：微波
家用微波炉的使用是不可取的。热点和冷点是常见的，导致不均一的抗原检索。抗原恢复时间通常较长，因为没有加压环境，几乎总是导致部分解离。科学的微波更合适。大多数品牌都有船上的压力容器，并可以保持温度恒定在98°C，以避免部分解离。
当使用该方法时，缓冲液沸腾是可能的，并且大量的检索缓冲器会蒸发。一定要注意滑动容器的缓冲液位，必要时再加上缓冲液。不要让幻灯片变干。
幻灯片应放置在塑料齿条和容器中。标准玻璃组织学染色架和容器在加热时会开裂。
材料和试剂
- 科学微波或家用（850 W）
- 带有滑动架的可微波容器，保持约400～500毫升或钴瓶
- 抗原回收缓冲液（如TrIS/EDTA pH 9，柠檬酸钠pH 6等）
方法
- 分离和复水切片。
使用足够量的抗原检索溶液覆盖幻灯片至少几厘米。 - 将合适的抗原回收缓冲液添加到可微波的容器中。
使用非密封容器以允许在沸腾过程中蒸发。一定要监测蒸发量，注意在操作过程中煮沸，不要让滑块干燥。 - 将幻灯片放在可微波炉中。将容器放入微波炉内。如果使用家用微波炉，设置满功率并等待溶液沸腾。从这个点煮沸20分钟。如果使用科学微波，程序，一旦温度达到98°C，抗原被回收20分钟。
使用非密封容器以允许在沸腾过程中蒸发。一定要监测蒸发量，注意在操作过程中煮沸，不要让滑块干燥。 - 20分钟后，取出容器，将冷自来水注入10分钟，用热溶液护理。
这允许幻灯片冷却足够，以便它们可以被处理，并且允许抗原位点在暴露于高温之后重新形成。 - 继续免疫组织化学染色。
热诱导表位检索方法：蔬菜蒸笼
许多实验室使用蔬菜蒸煮器或电饭煲进行热介导的抗原检索。该过程类似于微波，它保持缓冲液的温度在100℃，但没有微波法的剧烈沸腾。该方法可适用于在100°C代替水轮的水浴装置。
幻灯片应放置在塑料或金属齿条和容器中。标准玻璃组织学染色架和容器在加热时会开裂。
材料和试剂
- 蔬菜蒸笼
- 带有滑动架的容器保持约400～500毫升（或如果使用组织TEK容器250毫升）
- 抗原回收缓冲液（如TrIS/EDTA pH 9，柠檬酸钠pH 6）
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方法
- 将上述部分去污和复水。
- 根据厂家的指示和预热设置蔬菜蒸笼。
使用非密封容器以允许在沸腾过程中蒸发。一定要监测蒸发量，注意在操作过程中煮沸，不要让滑块干燥。 - 将适当的抗原回收缓冲液预热到烧瓶中煮沸。
- 把装有滑架的容器放进蔬菜蒸笼里。
- 小心地将热缓冲区添加到容器中，接着是滑动架。如果更方便，在将容器放入蒸笼之前，将缓冲液添加到容器中。
- 关上轮船的盖子。缓冲器的容器也应该有盖子。载玻片最初会使抗原回收液的温度下降，但在几分钟内它会恢复到95到100°C。
- 把容器放在蒸笼里20分钟。
- 20分钟后，取出容器，将冷自来水注入10分钟，用热溶液护理。
使用非密封容器以允许在沸腾过程中蒸发。一定要监测蒸发量，注意在操作过程中煮沸，不要让滑块干燥。 - 继续免疫组织化学染色。
酶抗原检索
使用的酶将在抗体数据表上显示。如果不是，胰蛋白酶可用于广泛的抗原，需要检索福尔马林/PFA固定。
至少有两种方法将酶溶液施加到组织上：直接将溶液移到载玻片上的组织上，或者将一组组织切片放入酶溶液容器中。第一种方法使用较少的试剂，但由于每个幻灯片需要单独处理，所以需要仔细监测每个幻灯片的孵育时间，以确保所有的幻灯片都接受相同的处理。因此，将大批量的幻灯片浸入酶溶液容器中更容易处理。如果使用自动染色系统（如VunANA），请咨询制造商以获得合适的酶回收方案。
吸液法：材料和试剂
- 37°C培养箱
- 加湿室（无论是培养箱本身还是湿纸巾容器）
- 具有滑动架的TBS的两个滑架容器
- 酶促抗原回收液（胰蛋白酶，见下文）
胰蛋白酶原液（蒸馏水中的0.5%）
- 胰蛋白酶50毫克
- 蒸馏水10毫升
- 混合溶解，储存在-20℃
氯化钙原液（1%）
胰蛋白酶工作液（0.05%）
- 胰蛋白酶原液（0.5%）1毫升
- 氯化钙原液1%毫升1毫升
- 蒸馏水8毫升
- 用1N NaOH将pH调节到7.8。储存在4℃下一个月或20℃长期贮存
移液法
- 制备胰蛋白酶溶液并预热至37°C。小心地将组织切片周围多余的水污渍，并将酶溶液（一般为50～100μL）移到切片上。可能需要用吸管尖端将溶液分散在切片周围，注意不要损伤组织。
- 将幻灯片放入加湿容器中，然后放入37°C培养箱中。避免将载玻片直接放在培养箱的架子上，因为温度会影响染色强度。理想地，保持载玻片的容器在孵化器中预热。
- 10至20分钟后（这将需要优化），从孵化器中移出幻灯片，并将其转移到自来水容器中的架子上。用自来水冲洗3分钟。
- 继续免疫组织化学染色。
浸渍法：材料和试剂
- 37°C水浴
- 滑动架和滑动架集装箱
- 酶促抗原回收液（用于胰蛋白酶，见酶促移液法）
浸渍法：浸渍法
一定要阅读你选择的酶的制造商的文献，因为一些酶需要特定的缓冲液和活性辅因子。
- 将水浴设定为所使用的酶的最佳温度。将超纯水加到两个可以容纳滑架的容器中。将容器放入水浴中加热。
使用足够量的水或缓冲器来覆盖滑块。 - 分离和复水段如上。将幻灯片放在一个水容器中取暖。
将冷滑片放入酶溶液中会降低溶液的温度，降低酶活性并导致抗原位点的检索不足。 - 从另一个容器中的温水中制备酶促抗原回收缓冲液，然后将容器返回到水浴中，以使溶液重新加热。
尽可能快地制备酶促抗原回收液，以避免酶活性受损。在引入幻灯片之前，允许该溶液返回温度。 - 将温热的幻灯片转移到酶溶液中10至20分钟，然后用间歇的温和搅拌，然后将幻灯片移开，放入自来水中冲洗3分钟。
检索时间应通过在酶溶液中孵育10, 15, 20、25和30分钟的组织切片来优化。I免疫组织化学染色。 - 继续免疫组织化学染色。
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