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IHC抗原检索协议

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                    ​了解抗原检索的两种方法:热介导(也称为热诱导表位检索或HIER)和酶。

                    打印此协议。



                    大多数福尔马林固定组织在免疫组织化学染色前需要抗原回收步骤。亚甲基桥在固定过程中形成交联蛋白并掩盖抗原位点。抗原提取方法打破这些亚甲基桥,暴露抗原位点,使抗体结合。抗原检索的两种方法是热诱导表位检索(HIER)和酶检索。

                    酶回收有时会破坏切片的形态,因此需要测试浓度和处理时间。

                    热诱导表位检索通常使用压力锅、微波炉或蔬菜蒸锅进行。一些实验室使用设置为60°C的水浴,并在回收溶液中培养载玻片过夜。当组织切片在较高温度下加热时从载玻片上脱落时,这很有用;尤其是骨骼、软骨和皮肤。

                    除非抗体数据表中规定了抗原检索方法,否则必须通过实验找到每个抗原的最佳方法。这也适用于选择用于热介导检索的缓冲区。我们建议测试几种方法,以找到最佳染色的检索方法。

                    方便的缓冲区,带来可靠的结果

                    为了获得热介导抗原检索的可靠结果,我们推荐我们预先制定的抗原检索缓冲液。这些缓冲液包括三种最常用的缓冲液-从我们的柠檬酸缓冲液套件,Tris-EDTA缓冲套件,或EDTA缓冲套件; 或使用我们的Tris缓冲套件.

                    我们还提供通用热介导抗原回收试剂盒(与我们领先的PD-L1克隆28-8一起使用),与大多数抗体兼容,不需要多个缓冲液。

                    对于酶抗原检索,我们建议胰蛋白酶溶液试剂盒。我们还提供胃蛋白酶溶液试剂盒和蛋白酶K溶液试剂盒.

                    或者,您可以准备自己的缓冲液和解决方案,并使用下面推荐的相同方法。



                    ​热诱导表位检索的缓冲溶液

                    以下解决方案是HIER中比较流行的三种缓冲区。在缺乏数据表信息的情况下,最好通过试验来选择检索缓冲区。

                    柠檬酸钠缓冲液(10 mM柠檬酸钠,0.05%吐温20,pH 6.0)

                    • 柠檬酸三钠(二水)2.94 g
                    • 蒸馏水1 L
                    • 混合溶解。用1N HCl调节pH至6.0。
                    • 添加0.5 mL吐温20并充分混合。在室温下储存3个月或
                    • 4°C,储存时间更长

                    1 mM EDTA,pH 8.0

                    • 乙二胺四乙酸0.37克
                    • 蒸馏水1 L
                    • 用NaOH调节至pH 8.0
                    • 在室温下储存3个月

                    Tris-EDTA缓冲液(10 mM Tris碱,1 mM EDTA溶液,0.05%吐温20,pH 9.0)

                    • Tris 1.21克
                    • 乙二胺四乙酸0.37克
                    • 蒸馏水1 L
                    • 混合溶解。将pH值调节至9.0。
                    • 添加0.5 mL吐温20并充分混合。在室温下储存3个月或在4°C下储存更长时间。


                    热诱导表位检索方法:压力锅

                    此过程中,应将滑块放在金属架上。

                    材料和试剂

                    • 家用不锈钢压力锅
                    • 加热板
                    • 带有滑架的容器,可容纳约400–500 mL
                    • 抗原回收缓冲液(Tris/EDTA pH 9.0,柠檬酸钠pH 6.0或其他)


                    方法

                    建议进行对照实验,以优化取回时间,取同一组织切片的载玻片1、2、3、4和5分钟,然后进行免疫组织化学染色。

                    1. 将适当的抗原回收缓冲液添加到压力锅中。把压力锅放在电炉上,然后把它打开。此时不要固定高压锅的盖子,只需将其放在顶部即可。在等待高压锅沸腾的同时,对部分进行脱油和再水化。
                    2. 煮沸后,将载玻片从自来水中转移到高压锅中。

                      小心使用热溶液–使用镊子。
                    3. 按照制造商的说明固定高压锅盖。
                    4. 一旦炊具达到全压,时间为3分钟。
                    5. 3分钟后,关闭加热板,将压力锅放在空水槽中。
                    6. 启动压力释放阀,将冷水浇到炊具上。减压后,打开盖子,向炊具内注入冷水10分钟。

                      这是为了让载玻片足够冷却,以便进行处理,并使抗原位点在暴露于高温后重新形成。

                      小心处理热溶液。
                    7. 继续免疫组织化学染色方案。
                      ​


                    热诱导表位检索方法:微波

                    不宜使用家用微波炉。热点和冷点很常见,导致抗原检索不均衡。由于缺乏加压环境,抗原提取时间通常较长,几乎总是导致切片分离。科学微波炉更合适。大多数品牌的船上都有压力容器,可以将温度保持在恒定的98°C,以避免分段分离。

                    使用此方法时,缓冲液可能会沸腾,大量检索缓冲液将蒸发。确保观察滑动容器的缓冲水平,必要时添加更多缓冲。不要让幻灯片变干。

                    本程序中,应将滑块放在塑料架和容器中。标准玻璃组织学染色架和血管在加热时会破裂。

                    ​材料和试剂

                    • 科学微波炉或家用(850 W)
                    • 带有滑架的微波容器,可容纳约400–500 mL或科普林斯罐
                    • 抗原回收缓冲液(例如Tris/EDTA pH 9.0、柠檬酸钠pH 6.0等)

                    方法

                    1. 脱蜡并重新脱水。

                      使用足够体积的抗原回收溶液将载玻片覆盖至少几厘米。
                    2. 将适当的抗原回收缓冲液添加到微波血管中。

                      使用非密封容器,以便在沸腾过程中蒸发。确保监测蒸发情况,并在操作过程中注意沸腾,不要让载玻片变干。
                    3. 将载玻片放入微波容器中。将容器置于微波炉内。如果使用家用微波炉,请将其设置为满功率,等待溶液沸腾。从这一点开始煮20分钟。如果使用科学微波炉,程序,以便在温度达到98°C时检索抗原20分钟。

                      使用非密封容器,以便在沸腾过程中蒸发。确保监测蒸发情况,并在操作过程中注意沸腾,不要让载玻片变干。
                    4. 20分钟后,取出容器,将冷自来水倒入其中10分钟。小心使用热溶液。

                      这使得载玻片足够冷却,以便可以进行处理,并允许抗原位点在暴露于高温后重新形成。
                    5. 继续免疫组织化学染色方案。



                    ​热诱导表位检索方法:蔬菜蒸笼

                    许多实验室使用蔬菜蒸锅或电饭煲进行热介导抗原检索。该程序与微波相似,因为它将缓冲液的温度保持在100°C,但没有微波法的剧烈沸腾。此方法可适用于设置在100°C的水浴,以代替蒸锅。

                    本程序中,应将滑块放置在塑料或金属架和容器中。标准玻璃组织学染色架和血管在加热时会破裂。

                    材料和试剂

                    • 蔬菜蒸笼
                    • 带有滑架的容器,可容纳约400–500 mL(如果使用Tissue-Tek容器,则为250 mL)
                    • 抗原回收缓冲液(例如Tris/EDTA pH 9.0,柠檬酸钠pH 6.0)

                      ​

                    方法

                    1. 如上所述,脱蜡并重新水化各部分。
                    2. 按照制造商的说明设置蔬菜蒸笼并预热。

                      使用非密封容器,以便在沸腾过程中蒸发。确保监测蒸发情况,并在操作过程中注意沸腾,不要让载玻片变干。
                    3. 将适当的抗原回收缓冲液在烧瓶中预热至沸腾。
                    4. 把盛载滑梯架的容器放入蔬菜蒸笼。
                    5. 小心地将热缓冲液添加到容器中,然后添加滑架。如果方便的话,在将容器放入蒸笼之前,将缓冲液添加到容器中。
                    6. 盖上蒸笼的盖子。缓冲液容器也应有盖子。载玻片架最初会降低抗原回收溶液的温度,但在几分钟内会恢复到95–100°C。
                    7. 从这一点开始,将容器放在蒸笼中20分钟。
                    8. 20分钟后,取出容器,将冷自来水倒入其中10分钟。小心使用热溶液。

                      使用非密封容器,以便在沸腾过程中蒸发。确保监测蒸发情况,并在操作过程中注意沸腾,不要让载玻片变干。
                    9. 继续免疫组织化学染色方案。



                    ​酶抗原检索

                    使用的酶将在抗体数据表上注明。如果没有,胰蛋白酶对需要回收福尔马林/PFA后固定的广泛抗原有用。

                    将酶溶液应用于组织至少有两种方法:直接用吸液管将溶液移到载玻片上的组织上,或将组织载玻片架放入酶溶液容器中。第一种方法使用较少的试剂,但由于每个载玻片都需要单独处理,因此需要仔细监测每个载玻片的培养时间,以确保所有载玻片均接受相同的处理。因此,将大批量的载玻片浸泡在酶溶液容器中更容易处理。如果使用自动染色系统(如Ventana),请咨询制造商以获取适当的酶回收协议。

                    移液方法:材料和试剂

                    • 37°C培养箱
                    • 加湿室(培养箱本身或带有湿纸巾的容器)
                    • 两个带滑架的TBS滑架集装箱
                    • 酶抗原回收液(胰蛋白酶,见下文)

                    胰蛋白酶原液(蒸馏水中0.5%)

                    • 胰蛋白酶50毫克
                    • 蒸馏水10 mL
                    • 混合溶解,储存于-20ºC

                    氯化钙储备液(1%)

                    • 氯化钙0.1克
                    • 蒸馏水10 mL
                    • 搅拌均匀并储存在4ºC下

                    胰蛋白酶工作液(0.05%)

                    • 胰蛋白酶原液(0.5%)1 mL
                    • 氯化钙储备液1%1 mL
                    • 蒸馏水8 mL
                    • 用1N NaOH将pH调节至7.8。在4ºC下储存一个月或-20ºC长期储存


                    移液方法:方法

                    1. 制备胰蛋白酶溶液并预热至37°C。小心地吸干组织切片周围多余的水,用吸管将酶溶液(通常50–100μL即可)移到切片上。可能需要用吸液管尖端将溶液分散在截面周围;小心不要损坏组织。
                    2. 将载玻片放入加湿容器中,然后放入37°C培养箱。避免将载玻片直接放在培养箱架上,因为温度会发生变化,从而影响染色强度。理想情况下,盛载载玻片的容器在培养箱中预先加热。
                    3. 10–20分钟后(这需要优化),将载玻片从培养箱中取出,并转移到装有自来水的容器中的支架上。用自来水冲洗3分钟。
                    4. 继续免疫组织化学染色方案。


                    浸渍法:材料和试剂

                    • 37°C水浴
                    • 滑架和滑架容器
                    • 酶抗原回收液(胰蛋白酶见酶回收移液法)


                    浸泡法:方法

                    请务必阅读制造商提供的有关所选酶的文献,因为有些酶需要特定的缓冲液和辅因子才能发挥活性。

                    1. 将水浴温度设置为所用酶的最佳温度。将超纯水添加到两个可容纳滑架的容器中。将容器放入水浴中加热。

                      用足够的水或缓冲液盖住幻灯片。
                    2. 如上所述,对部分脱蜡并重新水化。将幻灯片放在一个水容器中加热。

                      将冷载玻片放入酶溶液中会降低溶液的温度,降低酶的活性,导致抗原位点的回收不足。
                    3. 从另一个容器中的温水中制备酶抗原回收缓冲液,然后将容器返回水浴,使溶液重新加热。

                      尽快制备酶抗原回收溶液,以避免损害酶的活性。在引入载玻片之前,让溶液恢复到温度。
                    4. 将加热后的载玻片转移到酶溶液中10–20分钟,并间歇轻轻搅拌,然后取出载玻片并将其放在流动自来水中3分钟,以冲洗掉酶。

                      应通过在酶溶液中培养组织切片10、15、20、25和30分钟来优化检索时间我免疫组织化学染色。
                    5. 继续免疫组织化学染色方案。



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