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了解抗原检索的两种方法:热介导(也称为热诱导表位检索或HIER)和酶。
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大多数福尔马林固定组织在免疫组织化学染色前需要抗原回收步骤。亚甲基桥在固定过程中形成交联蛋白并掩盖抗原位点。抗原提取方法打破这些亚甲基桥,暴露抗原位点,使抗体结合。抗原检索的两种方法是热诱导表位检索(HIER)和酶检索。
酶回收有时会破坏切片的形态,因此需要测试浓度和处理时间。
热诱导表位检索通常使用压力锅、微波炉或蔬菜蒸锅进行。一些实验室使用设置为60°C的水浴,并在回收溶液中培养载玻片过夜。当组织切片在较高温度下加热时从载玻片上脱落时,这很有用;尤其是骨骼、软骨和皮肤。
除非抗体数据表中规定了抗原回收方法,否则必须通过实验找到每种抗原的最佳方法。这也适用于选择用于热介导检索的缓冲区。我们建议测试几种方法,以找到最佳染色的检索方法。
方便的缓冲区,带来可靠的结果
为了获得热介导抗原检索的稳健结果,我们推荐我们预先制定的抗原检索缓冲液。其中包括三种最常用的缓冲区-从我们的柠檬酸缓冲液套件,Tris-EDTA缓冲套件,或EDTA缓冲套件; 或使用我们的Tris缓冲套件.
我们还提供通用热介导抗原回收试剂盒(与我们领先的PD-L1克隆28-8一起使用),与大多数抗体兼容,不需要多个缓冲液。
对于酶抗原检索,我们建议胰蛋白酶溶液试剂盒。我们还提供胃蛋白酶溶液试剂盒和蛋白酶K溶液试剂盒.
或者,您可以准备自己的缓冲液和解决方案,并使用下面推荐的相同方法。
以下解决方案是HIER中比较流行的三种缓冲区。在缺乏数据表信息的情况下,最好通过试验来选择检索缓冲区。
柠檬酸钠缓冲液(10 mM柠檬酸钠,0.05%吐温20,pH 6.0)
1 mM EDTA,pH 8.0
Tris-EDTA缓冲液(10 mM Tris碱,1 mM EDTA溶液,0.05%吐温20,pH 9.0)
此过程中,应将滑块放在金属架上。
材料和试剂
方法
建议进行对照实验,以优化取回时间,取同一组织切片的载玻片1、2、3、4和5分钟,然后进行免疫组织化学染色。
不宜使用家用微波炉。热点和冷点很常见,导致抗原检索不均衡。由于缺乏加压环境,抗原提取时间通常较长,几乎总是导致切片分离。科学微波炉更合适。大多数品牌的船上都有压力容器,可以将温度保持在恒定的98°C,以避免分段分离。
使用此方法时,缓冲液可能会沸腾,大量检索缓冲液将蒸发。确保观察滑动容器的缓冲水平,必要时添加更多缓冲。不要让幻灯片变干。
本程序中,应将滑块放在塑料架和容器中。标准玻璃组织学染色架和血管在加热时会破裂。
材料和试剂
许多实验室使用蔬菜蒸锅或电饭煲进行热介导抗原检索。该程序与微波相似,因为它将缓冲液的温度保持在100°C,但没有微波法的剧烈沸腾。此方法可适用于设置在100°C的水浴,以代替蒸锅。
本程序中,应将滑块放置在塑料或金属架和容器中。标准玻璃组织学染色架和容器在加热时会破裂。
使用的酶将在抗体数据表上注明。如果没有,胰蛋白酶对需要回收福尔马林/PFA后固定的广泛抗原有用。
将酶溶液应用于组织至少有两种方法:直接用吸液管将溶液移到载玻片上的组织上,或将组织载玻片架放入酶溶液容器中。第一种方法使用较少的试剂,但由于每个载玻片都需要单独处理,因此需要仔细监测每个载玻片的培养时间,以确保所有载玻片均接受相同的处理。因此,将大批量的载玻片浸泡在酶溶液容器中更容易处理。如果使用自动染色系统(如Ventana),请咨询制造商以获取适当的酶回收协议。
移液方法:材料和试剂
胰蛋白酶原液(蒸馏水中0.5%)
氯化钙储备液(1%)
胰蛋白酶工作液(0.05%)
移液方法:方法
浸渍法:材料和试剂
浸泡法:方法
请务必阅读制造商提供的有关所选酶的文献,因为有些酶需要特定的缓冲液和辅因子才能发挥活性。
您也可以通过Abcam应用程序直接从手机访问我们最流行的协议,该应用程序具有协议、科学支持和一套有用的工具,对任何实验室科学家来说都很方便。了解更多信息.