抗-p27 KIP 1[Y236]（ab32034）

Western blot：抗CDKN1B抗体[Y236]（ab32034）在1/5000稀释度下染色，以绿色显示；小鼠抗α-管蛋白[DM1A](约7291)1/2000稀释度下的加载对照染色，以品红色显示。在Western blot中，ab32034显示与CDKN1B特异性结合。在野生型HCT 116细胞裂解物中观察到30kDa的条带，而在CDKN1B敲除细胞系中没有观察到该大小的信号。为了生成此图像，分析了野生型和CDKN1B敲除HCT 116细胞裂解物。首先，样品在SDS-PAGE凝胶上运行，然后转移到硝化纤维素膜上。TBS-0.1%吐温中3%牛奶中的膜被堵塞^®20（TBS-T），然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。在TBS-T中清洗四次斑点，在室温下与二级抗体孵育1小时，再次清洗四次，然后成像。二级抗体为羊抗兔IgG H&L 800CW和羊抗鼠IgG H&L 680RD，稀释度为1/20000。

Western blot假彩色图像：1/5000稀释的抗-p27 KIP 1抗体[Y236]染色，以绿色显示；小鼠抗α-管蛋白[DM1A](约7291)以1/20000稀释度进行负载控制染色，以红色显示。在Western blot中，ab32034显示与p27 KIP 1特异性结合。在野生型RAW 264.7细胞裂解液中28 kDa处观察到一条带，在CDKN1B敲除细胞系中未观察到该大小的信号约281619（敲除细胞裂解物约282970). 为了生成此图像，分析了野生型和CDKN1B敲除RAW 264.7细胞裂解物。首先，样品在SDS-PAGE凝胶上运行，然后转移到硝化纤维素膜上。TBS-0.1%吐温中3%牛奶中的膜被堵塞^®20（TBS-T），然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。在TBS-T中清洗四次斑点，在室温下与二级抗体孵育1小时，再次清洗四次，然后成像。使用的二级抗体是山羊抗兔IgG H&L（IRDye^®800CW）预吸收床(ab216773号)和山羊抗鼠IgG H&L（IRDye^®680RD）预吸收床(约216776)稀释1/20000。

车道1：野生型HAP1全细胞裂解物（20µg）
车道2：CDKN1B敲除HAP1全细胞裂解物（20µg）
3号车道：HeLa全细胞裂解物（20µg）
车道4：MCF7全细胞裂解物（20µg）

1-4车道：合并信号（红色和绿色）。绿色-在30 kDa下观察到ab32034。红色-装载控制，约8245，在37 kDa下观察到。

未纯化的ab32034在野生型HAP1细胞中与CDKN1B特异性反应。使用CDKN1B敲除样品时未观察到条带。对野生型和CDKN1B基因敲除样品进行SDS-PAGE分析。ab32034和约8245（小鼠抗GAPDH负载对照）分别在1/1000和1/10000的温度下在4°C下孵育过夜。在成像前，用800CW山羊抗兔和680CW山羊抗鼠二级抗体在室温下以1/10000稀释1小时制备印迹。

用纯化ab32034在1:50稀释（10.4μg/ml）条件下标记p27 KIP 1的人宫颈癌组织切片的免疫组织化学（福尔马林/PFA-固定石蜡包埋切片）分析。热介导抗原检索使用约93684（Tris/EDTA缓冲液，pH 9.0）。组织用苏木精复染。免疫组织探针一步法HRP聚合物（即用型）二级抗体以1:0的稀释度使用。使用PBS代替初级抗体作为阴性对照。

ab32034（纯化），1/30稀释（20µg/mL），免疫沉淀C6全细胞裂解液中的p27 KIP 1。
通道1（输入）：C6（大鼠胶质瘤胶质细胞）全细胞裂解液10µg
通道2（+）：ab32034和C6全细胞裂解物
通道3（-）：兔单克隆IgG(约172730)而不是C6全细胞裂解液中的ab32034
对于western blotting，ab32034为1/500稀释度（1.044µg/mL），VeriBlot为IP检测试剂（HRP）(阿布131366)在1/1000稀释度下用于检测。
封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST。

NIH/3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）细胞的细胞内流式细胞术分析，以1/500稀释度（5.22µg/ml）的ab32034标记p27 KIP 1（红色）。细胞用4%多聚甲醛固定。山羊抗兔IgG（Alexa Fluor^®488,约150077)以1/2000稀释度作为二级抗体。同位素对照-兔单克隆IgG(约172730)（黑色）。未标记控件-未标记单元格（蓝色）。

显示用ab32034染色的HAP1野生型（绿线）和HAP1-CDKN1B敲除细胞（红线）的叠加直方图。用80%甲醇固定细胞（5分钟），然后用0.1%PBS-Triton X-100渗透15分钟。然后在1x PBS/10%正常山羊血清中培养细胞，以阻止非特异性蛋白质相互作用，随后在22°C下用抗体（ab32034，1µg/ml）培养30分钟。使用的第二抗体是Alexa Fluor^®488山羊抗兔IgG（H&L）预吸收(约150081)在22°C下以1/2000稀释30分钟。一种兔IgG同型控制抗体(约172730)在与第一抗体相同的浓度和条件下使用（HAP1野生型-黑线，HAP1-CDKN1B敲除-灰线）。未标记样本也用作对照（为了简单起见，未显示此行）。使用50 mW蓝光激光器（488nm）和530/30带通滤波器采集了超过5000个事件。该抗体也可用于用4%PFA固定的HAP1细胞（10分钟），在相同条件下用0.1%PBS Triton X-100透化15分钟。 

ab32034（纯化）1/20稀释（2μg）免疫沉淀p27 KIP 1在MCF7（人乳腺癌上皮细胞）全细胞裂解液中。

车道1（输入）：MCF7（人乳腺癌上皮细胞）全细胞裂解物10μg
车道2（+）：ab32034和MCF7（人乳腺癌上皮细胞）全细胞裂解物
车道3（-）：兔单克隆IgG(约172730)代替MCF7（人乳腺癌上皮细胞）全细胞裂解液中的ab32034

用于蛋白质印迹，用于IP检测试剂（HRP）的VeriBlot(阿布131366)在1/1000稀释度下用于检测。
封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST。

用纯化ab32034在1/50稀释度（10µg/ml）（红色）下标记p27 KIP 1的MCF7（人乳腺癌上皮细胞）细胞的细胞内流式细胞术分析。细胞用4%多聚甲醛固定，用90%甲醇渗透。山羊抗兔IgG（Alexa Fluor^®488）二级抗体以1/2000稀释度使用。同位素对照-兔单克隆IgG（黑色）。未标记对照-未与一级抗体和二级抗体孵育的细胞（蓝色）。 

封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST

封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST

石蜡包埋人乳腺癌的免疫组织化学分析。热介导抗原检索使用约93684（Tris/EDTA缓冲液，pH 9.0）。

用纯化ab32034标记p27 KIP 1（绿色）的HeLa（人宫颈腺癌）细胞的免疫细胞化学/免疫荧光分析（1/500）。细胞用4%多聚甲醛固定，并用0.1%Triton X-100渗透。约150077，Alexa Fluor公司^®用488-结合羊抗兔IgG（1/1000）作为二级抗体。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

仅二级对照：用PBS代替一级抗体作为阴性对照。

用细胞内流式细胞术对人乳腺癌MCF-7细胞系中p27 KIP1进行未纯化ab32034染色。用4%多聚甲醛固定细胞，用90%甲醇渗透，样品与一级抗体以1/20的稀释度孵育。山羊抗兔IgG（Alexa Fluor^®488）作为第二抗体。 

同型对照：兔单克隆IgG（黑色）

未标记对照：未与一级抗体和二级抗体孵育的细胞（蓝色）

未纯化的ab32034在卵巢癌组织中呈阳性染色。热介导抗原检索使用约93684（Tris/EDTA缓冲液，pH 9.0）。

NS398处理的MCF7细胞中未纯化的ab32034染色p27 KIP1(约120295)如文献所述，p27 KIP1表达增加与NS 398浓度增加相关。
细胞在37°C的培养基中培养6小时，培养基中含有不同浓度的约120295（NS 398）在DMSO中，室温下用4%甲醛固定10分钟，室温下使用含有10%山羊血清、0.3M甘氨酸、1%牛血清白蛋白和0.1%吐温的PBS封闭2小时。在含有1%BSA和0.1%吐温的PBS中，在4°C下用ab32034（1/100稀释液）对处理过的细胞进行过夜染色。DyLight 488羊抗兔多克隆抗体(约96899)以1/250稀释液作为二级抗体。

未纯化的ab32034在结肠腺癌组织中呈阳性染色。热介导抗原检索使用约93684（Tris/EDTA缓冲液，pH 9.0）。

未纯化的ab32034在胶质瘤组织中呈阳性染色。热介导抗原检索使用约93684（Tris/EDTA缓冲液，pH 9.0）。

未纯化的ab32034在胃腺癌组织中呈阳性染色。热介导抗原检索使用约93684（Tris/EDTA缓冲液，pH 9.0）。