重组抗雌激素受体α抗体[E115]-ChIP等级（ab32063）

稀释1/5000用ab32063对石蜡包埋的人子宫内膜组织进行免疫组织化学染色。使用的二级抗体是山羊抗狂犬病IgG H&L（HRP聚合物）。用苏木精对样品进行反染色。抗原检索通过热介导使用约93684（Tris/EDTA缓冲液，pH 9.0）

人子宫内膜细胞核染色。

封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST。

ER66在子宫中高表达，在卵巢中中等表达，在肾、肺、脑、肝、心脏中低表达（PMID:20861365、24977106、23675257、23940668、22070562），特别是在雄性或幼龄雌性动物的组织中表达较低（PMID:26384003、23940.68）。ab32063不适合检测卵巢和雌激素受体α低表达组织的western blot。

4%对甲醛固定、0.1%Triton X-100透性4T1（小鼠乳腺癌上皮细胞系）细胞的免疫荧光分析，在1/200稀释度下用抗雌激素受体α一级抗体（ab32063）标记雌激素受体α，然后用山羊抗狂犬病IgG H&L（Alexa Fluor^® 488) (约150081)二级抗体，稀释度为1/1000（2.0µg/mL）。共聚焦图像显示4T1细胞的细胞质和细胞核染色。抗α-管蛋白小鼠单克隆抗体-微管标记（Alexa Fluor^® 594) (约195889年)用于在1/200稀释度（2.5µg/mL）下对微管蛋白进行复染。核反染为DAPI（蓝色）。

二级抗体唯一控制为：二级抗体为约150081山羊抗狂犬病IgG H&L（Alexa Fluor^®488），稀释度为1/1000（2.0µg/mL）。

4%对甲醛固定、0.1%Triton X-100渗透性GH3（大鼠垂体上皮细胞系）细胞的免疫荧光分析，在1/200稀释度下用抗雌激素受体α一级抗体（ab32063）标记雌激素受体α，然后用山羊抗狂犬病IgG H&L（Alexa Fluor^® 488) (约150081)二级抗体，稀释度为1/1000（2.0µg/mL）。共聚焦图像显示GH3细胞的细胞质和细胞核染色。抗α-管蛋白小鼠单克隆抗体-微管标记（Alexa Fluor^® 594) (约195889年)用于在1/200稀释度（2.5µg/mL）下对微管蛋白进行复染。核反染为DAPI（蓝色）。

二级抗体唯一控制为：二级抗体为约150081山羊抗狂犬病IgG H&L（Alexa Fluor^®488），稀释度为1/1000（2.0µg/mL）。

MCF-7细胞的免疫细胞化学/免疫荧光分析，用纯化的ab32063标记1/1000的雌激素受体α。细胞用4%多聚甲醛固定，并用0.1%Triton X-100渗透。约150077，Alexa Fluor^®用488-结合羊抗兔IgG（1/1000）作为二级抗体。这些细胞与约7291，小鼠抗微管蛋白（1/1000）使用ab150120型，Alexa Fluor^®594-结合羊抗鼠IgG（1/1000）作为二级抗体。细胞核用DAPI（蓝色）进行复染。

对照1：一级抗体（1/1000）和二级抗体，ab150120型，Alexa Fluor^®594-共轭山羊抗鼠IgG（1/1000）。

控制2：约7291（1/1000）和二级抗体，约150077，Alexa Fluor^®488-共轭山羊抗兔IgG（1/1000）。

使用人乳腺癌MCF7细胞中未纯化的ab32063结合雌激素受体α进行ChIP分析。用1%甲醛交联细胞10分钟。样品与未稀释的一级抗体在4°C下孵育16小时。采用实时PCR检测蛋白质结合。
阳性对照：在PS2启动子处测试雌激素处理的MCF7细胞。
阴性对照：在PS2启动子检测IgG-ChIP和乙醇消除细胞。

参见Abreview

重叠直方图显示未纯化ab32063染色的MCF7细胞（红线）。用4%多聚甲醛固定细胞（10分钟），然后用0.1%PBS-Tween渗透20分钟。然后在1x PBS/10%正常山羊血清/0.3M甘氨酸中培养细胞，以阻止非特异性蛋白质相互作用，然后在22°C下用抗体（ab32063，1/1000稀释）培养30分钟。使用的二级抗体是Alexa Fluor^®488山羊抗兔IgG（H+L）(约150077)在22°C下以1/2000稀释30分钟。同型对照抗体（黑线）为兔IgG（单克隆）（1µg/1x10⁶电池）在相同条件下使用。未标记样本（蓝线）也用作对照。使用20mW氩离子激光器（488nm）和525/30带通滤波器采集了超过5000个事件。该抗体在80%甲醇（5分钟）固定/0.1%PBS-Tween渗透20分钟的MCF7细胞中呈阳性信号

用ab32063对石蜡包埋的人乳腺癌组织进行免疫组织化学染色，稀释度为1/5000。使用的二级抗体是山羊抗狂犬病IgG H&L（HRP聚合物）。用苏木精对样品进行反染色。抗原检索通过热介导使用约93684（Tris/EDTA缓冲液，pH 9.0）。

人类乳腺癌细胞核染色。

封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST

稀释1/5000用ab32063对石蜡包埋的人类乳腺组织进行免疫组织化学染色。使用的二级抗体是山羊抗狂犬病IgG H&L（HRP聚合物）。用苏木精对样品进行反染色。抗原检索通过热介导使用约93684（Tris/EDTA缓冲液，pH 9.0）。

人类乳房上的核染色。

用纯化的ab32063以1/200的工作稀释度对石蜡包埋的人子宫内膜癌进行免疫组织化学染色。使用的二级抗体是ab97051型，HRP山羊抗兔IgG（H+L），1/500。用苏木精对样品进行反染色。使用pH 9.0的Tris-EDTA缓冲液进行抗原检索。

暴露时间：1^标准车道：85秒
                         2^第车道：32秒

封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST

抗雌激素受体α（ab32063，未纯化）1:50稀释液对人乳腺癌的免疫组织化学分析

用纯化的ab32063以1/250的稀释度对MCF7细胞（用4%PFA固定并用TritonX 100渗透）进行免疫荧光染色。Alexa Fluor公司^®555羊抗兔抗体作为次级抗体，稀释度为1/200。右侧面板显示DAPI反训练。

染色质由MCF-7+β-雌二醇和MCF-7细胞根据Abcam X-ChIP协议制备30分钟。用甲醛固定细胞10分钟。使用25μg染色质、4μg纯化ab32063（蓝色）和20μL抗兔IgG琼脂糖珠进行ChIP。将兔正常IgG添加到珠子对照组（黄色）。免疫沉淀DNA通过实时PCR（SYBR方法）定量。引物位于TFF1基因的第二内含子。

MCF7细胞处理如下：

MCF-7饥饿过夜，然后在2%FBS培养基中用10 nMβ-雌二醇处理30分钟。

对照组MCF-7饥饿过夜，然后在2%的FBS培养基中培养30分钟。

底漆信息：

位于TFF1基因的2内含子。

顺序：

前进：5'-agtcctcccaacctt-3'

背面：5'-ttcggccatctct-3'