重组抗EGFR[EP38Y]（ab52894）

用浓度为0.1µg/ml的ab52894对福尔马林固定石蜡包埋的人胎盘标记EGFR进行免疫组织化学分析。在Ventana DISCOVERY ULTRA（Roche Tissue Diagnostics）仪器上用OptiView DAB IHC检测试剂盒进行免疫染色。使用ULTRA细胞调节液（CC1，pH 8.5）在100°C下进行32分钟的热介导抗原回收。ab52894抗-EGFR抗体[EP38Y]在37°C下孵育16分钟。切片用苏木精II复染。图像插页显示仅二级抗体对照组无染色。

用浓度为0.21µg/ml的ab52894对福尔马林固定石蜡包埋的人胎盘标记EGFR进行免疫组织化学分析。免疫染色在带有BOND™Polymer Refine检测试剂盒的Leica Biosystems BOND®RX仪器上进行。用Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0，表位检索溶液2）进行热介导抗原检索20分钟。ab52894抗-EGFR抗体[EP38Y]在室温下孵育30分钟。切片用苏木精复染。图像插页显示仅二级抗体对照组无染色。

HCT116细胞球体中EGFR的ab52894染色。细胞用4%甲醛固定（10分钟），用0.5%Triton X-100渗透1h，然后用1%BSA/10%正常山羊血清/0.3M甘氨酸在0.1%PBS-Tween中隔夜室温下封闭。然后在室温下用ab52894以2µg/ml和约7291，小鼠单克隆[DM1A]以2µg/ml的速度与α-管蛋白结合。DAPI用作核复染（以蓝色显示）。作为第二抗体约150081山羊抗兔（Alexa Fluor^®488）（以绿色显示）和ab150120型山羊抗鼠（Alexa Fluor^®594）（以洋红色显示），在室温下培养过夜。所有渗透、封闭和抗体培养步骤均使用旋转振动筛进行。

使用高含量分析仪（Operetta CLS、Perkin Elmer）采集图像，并显示共焦截面的最大强度投影。

抗体ab52894也使用100%甲醇（5分钟）起作用。

Western blot：抗-EGFR抗体[EP38Y]（ab52894）在1/1000稀释液中染色，以绿色显示；小鼠抗α-管蛋白[DM1A](约7291)以1/20000稀释度加载控制染色，以洋红色显示。在Western blot中，ab52894显示与EGFR特异结合。在野生型A549细胞裂解液中观察到175kDa的条带，在EGFR敲除细胞系中未观察到该大小的信号。为了生成此图像，分析了野生型和EGFR敲除A549细胞裂解物。首先，样品在SDS-PAGE凝胶上运行，然后转移到硝化纤维素膜上。在4°C下与主要抗体孵育过夜之前，在TBS-0.1%吐温®20（TBS-T）中的5%牛奶中封闭膜。将印迹在TBS-T中洗涤四次，在室温下与第二抗体孵育1小时，再次洗涤四次，然后成像。使用的二级抗体是山羊抗兔IgG H&L 800CW和山羊抗小鼠IgG H&L 680RD，稀释度为1/2000。

免疫组化分析中使用ab52894对组织芯片进行抗-EGFR抗体[EP38Y]染色。本表详细概述了每种测试样本类型的阳性（勾号）和阴性（交叉标记）染色。用Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0，表位检索溶液2）对切片进行热介导抗原检索预处理20分钟。该切片在室温下与ab52894孵育30分钟。在徕卡生物系统BOND®RX仪器上进行免疫染色

封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST

1-4车道：合并信号（红色和绿色）。绿色-在175 kDa下观察到ab52894。红色-装载控制，约130007在125 kDa时观察到。  

ab52894在野生型HeLa中与EGFR反应。敲除细胞系时观察到信号丢失ab255385号（敲除细胞裂解物约263845)已使用。对野生型和EGFR敲除样品进行SDS-PAGE分析。ab52894和抗V蛋白抗体[VIN-54](约130007)分别在4°C下以1/1000稀释度和1/20000稀释度培养过夜。用山羊抗兔IgG H&L（IRDye^®800CW）预吸附床(ab216773号)和山羊抗鼠IgG H&L（IRDye^®680RD）预吸附床(约216776)二级抗体在成像前在室温下以1:20000稀释1小时。

封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST

未纯化的ab52894染色的A431（人表皮样癌细胞系）细胞。

细胞在-20°C的100%甲醇中固定5分钟，然后在室温下在1%BSA/10%正常山羊血清/0.3M甘氨酸和0.1%PBS-Tween中孵育1小时，以使细胞渗透并阻断非特异性蛋白-蛋白质相互作用。然后将细胞与抗体（ab52894，1/500）在+4°C下孵育过夜。二级抗体（伪绿色）为山羊抗狂犬病IgG H&L（Alexa Fluor^®488）预吸附层(约150081)在室温下以1/1000的稀释度使用1小时。Alexa Fluor公司^®594 WGA用于在室温下以1/200稀释度标记质膜（伪彩色红色）1小时。DAPI用于在室温下以1.43µM的浓度对细胞核（伪蓝色）染色1小时。

用ab52894对1000 ng/ml的人EGFR重组蛋白进行ELISA分析。使用1/2500稀释的碱性磷酸酶缀合的AffiniPure山羊抗兔IgG（H+L）作为第二抗体。

该印迹是在MOPS缓冲系统下使用4-12%双三凝胶生成的。凝胶在200V下运行50分钟，然后在30V下转移到硝化纤维素膜上70分钟。然后将膜封闭一小时，然后在4°C温度下与未纯化的ab52894在负载控制下孵育过夜约18058（小鼠单克隆[SPM227]与文丘林按1:10000稀释）。在成像前，使用IR标记的山羊抗兔抗体在室温下以1:10000稀释1小时检测抗体结合。

该产品使用A431（人类鳞癌）裂解液在western blot中产生强烈信号，该裂解液自然过度表达EGFR蛋白。对于内源性EGFR水平较低的细胞系和组织，可能需要优化Western blot条件。

用1:100稀释（0.95μg/ml）的纯化ab52894标记EGFR的人宫颈癌组织切片的免疫组织化学（福尔马林/PFA-固定石蜡包埋切片）分析。

使用pH 9.0的EDTA缓冲液进行热介导抗原检索。组织用苏木精复染。ab97051型山羊抗狂犬病IgG H&L（HRP）二级抗体采用1:500稀释。以PBS代替一抗作为阴性对照。

A431（人表皮样癌上皮细胞）细胞的免疫细胞化学/免疫荧光分析，以1:250稀释度（0.4μg/ml）用纯化的ab52894标记EGFR。

细胞固定在4%多聚甲醛中，并用0.1%Triton X-100渗透。细胞被复染约195889年抗α-管蛋白抗体[DM1A]-微管标记物（Alexa Fluor^®594）1:200（2.5μg/ml）。约150077山羊抗兔IgG（Alexa Fluor^®488）作为二级抗体，稀释度为1:1000。DAPI核复染。

用PBS代替一级抗体作为二级抗体对照。

用纯化的ab52894标记EGFR的A431（人表皮样癌上皮细胞）细胞的细胞内流式细胞术分析

用4%多聚甲醛固定细胞（10分钟），用90%甲醇渗透30分钟。然后在1x PBS/10%正常山羊血清中孵育，以阻断非特异性蛋白-蛋白质相互作用，然后在1/20稀释度（红色）下孵育ab52894 30分钟。山羊抗兔IgG（Alexa Fluor^®488）二级抗体以1/2000稀释度使用。同位素对照-兔单克隆IgG（黑色）。未标记对照-未与一级抗体和二级抗体孵育的细胞（蓝色）。 

ab52894（纯化），1:20稀释（0.5µg），在HeLa（人宫颈腺癌上皮细胞）全细胞裂解物中免疫沉淀EGFR。

车道1（输入）：HeLa全细胞裂解液10µg

车道2（+）：HeLa全细胞裂解液中的ab52894

车道3（-）：兔单克隆IgG(约172730)代替HeLa全细胞裂解液中的ab52894

用于蛋白质印迹，用于IP检测试剂（HRP）的VeriBlot(阿布131366)用于1:1000稀释度的检测。

封闭和稀释缓冲液：5%NFDM/TBST。