重组抗CD146抗体[EPR3208]（ab75769）

车道1：野生型HAP1全细胞裂解物（40µg）
车道2：CD146敲除HAP1全细胞裂解物（40µg）
3号车道：A375全细胞裂解物（20µg）

1-4车道：合并信号（红色和绿色）。绿色-在120-72 kDa时观察到ab75769。红色-装载控制，约9484，在37 kDa下观察到。

ab75769在野生型HAP1细胞中与CD146特异性反应，因为CD146敲除细胞中信号丢失。对野生型和CD146敲除样品进行SDS-PAGE分析。ab75769和约9484（小鼠抗GAPDH负荷对照）分别在4°C下以1/10000稀释度和1/20000稀释度孵育过夜。用山羊抗兔IgG H&L（IRDye^®800CW）预吸收床ab216773号和山羊抗小鼠IgG H&L（IRDye^®680RD）预吸收床约216776在成像前在室温下以1/10000稀释1小时的二次抗体。

免疫组织化学实验用于比较有症状的颈动脉斑块（SC）和无症状的颈动脉粥样硬化斑块（AsC）

无症状病灶表现为较高的CD146⁺周细胞浸润，p<0.001。代表性图像位于左侧，相应的量化图像位于右侧。

ab75769在1/200稀释度下使用。

（根据Davaine等人的图2）

A375（人类恶性黑色素瘤）细胞的免疫细胞化学/免疫荧光分析，用纯化的ab75769标记CD146（1/250）。细胞用4%多聚甲醛固定，并用0.1%Triton X-100渗透。约150077，Alexa Fluor^®使用488缀合的山羊抗兔IgG（1/500）作为第二抗体。DAPI（蓝色）用作核染色。约7291、小鼠抗微管蛋白（1/1000）和ab150120型，Alexa Fluor^®还使用了594-共轭山羊抗鼠IgG（1/1000）。

对照1：一级抗体（1/100）和二级抗体，ab150120型，Alexa Fluor^®594-共轭山羊抗鼠IgG（1/500）。

控制2：约7291（1/1000）和二级抗体，约150077，Alexa Fluor^®488-共轭山羊抗兔IgG（1/500）。

免疫组织化学（福尔马林/PFA-固定石蜡包埋切片）分析人脾组织标记CD146，纯化ab75769为1/250。使用Tris/EDTA缓冲液pH 9进行热介导抗原检索。ab97051型以羊抗兔IgG H&L（HRP）作为二级抗体（1/500）。阴性对照使用PBS代替一抗。苏木精复染。

在1/20稀释度（10ug/mL）（红色）下用未纯化ab75769标记CD146的A375（人类恶性黑色素瘤）细胞的细胞内流式细胞术分析。细胞用4%多聚甲醛固定，用90%甲醇渗透。山羊抗兔IgG（Alexa Fluor^®488）以1/2000稀释度作为二级抗体。使用兔单克隆IgG（黑色）作为同型对照，使用未与一级抗体和二级抗体孵育的细胞（蓝色）作为未标记对照。 

1-2车道：合并信号（红色和绿色）。绿色-在120 kDa下观察到ab75769。红色-抗-GAPDH抗体[6C5]-负荷控制(约8245)在37 kDa时观察到。

western blot显示ab75769与野生型HeLa细胞中的CD146反应。CRISPR/Cas9编辑细胞系中观察到的条带约261790（CRISPR/Cas9编辑的细胞裂解物约256985)120kDa以下的车道可能代表截断形式和劈开碎片。尚未对此进行进一步调查。对野生型HeLa和MCAM CRISPR/Cas9编辑的HeLa细胞裂解液进行SDS-PAGE分析。在室温下，将膜在0.1%的TBST和3%的脱脂奶粉中封闭1小时。ab75769和抗-GAPDH抗体[6C5]-负荷控制(约8245)分别以1/1000和1/20000的稀释度在4°C下培养过夜。用山羊抗兔IgG H&L（IRDye^®800CW）预吸附床(ab216773号)和山羊抗鼠IgG H&L（IRDye^®680RD）预吸附床(约216776)二级抗体在成像前在室温下以1:20000稀释1小时。

封闭缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。
稀释缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。

封闭缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。
稀释缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。

封闭缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。
稀释缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。

封闭缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。
稀释缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。

免疫组织化学（福尔马林/PFA-固定石蜡包埋切片）分析黑色素瘤组织标记CD146，未纯化ab75769为1/250。使用HRP/AP聚合二级抗体。

在开始IHC染色方案之前，通过压力锅方法进行热介导抗原检索。

乳腺癌血管的免疫组织化学（福尔马林/PFA-固定石蜡包埋切片）分析，用未纯化的ab75769标记CD146。

在开始IHC染色方案之前，通过压力锅方法进行热介导抗原检索。

用未纯化的ab75769对膀胱移行癌血管组织标记CD146进行免疫组织化学（福尔马林/PFA-固定石蜡包埋切片）分析。

在开始IHC染色方案之前，通过压力锅方法进行热介导抗原检索。

神经胶质瘤血管的免疫组织化学（福尔马林/PFA固定石蜡包埋切片）分析用未纯化的ab75769标记CD146的组织。

在开始IHC染色方案之前，通过压力锅方法进行热介导抗原检索。

正常扁桃体组织用未纯化ab75769标记CD146的免疫组织化学（福尔马林/PFA-固定石蜡包埋切片）分析。

在开始IHC染色方案之前，通过压力锅方法进行热介导抗原检索。

正常脾组织用未纯化ab75769标记CD146的免疫组织化学（福尔马林/PFA-固定石蜡包埋切片）分析。

在开始IHC染色方案之前，通过压力锅方法进行热介导抗原检索。

HUVEC细胞的细胞内流式细胞术分析，用纯化的ab75769标记CD146，浓度为1/50（红色）。细胞用2%多聚甲醛固定。以FITC-偶联山羊抗兔IgG（1/150）作为二级抗体。黑色-同位素对照，兔单克隆IgG。蓝色-未标记对照，细胞未与初级和次级抗体孵育。